基于不同电化学探针检测乳腺癌基因片段电化学传感器的研究

贺彩梅，胡晓琴，刘舒萍，李晓霞

(延安大学 化学与化工学院,陕西 延安 716000)

乳腺癌是当前严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势。早期乳腺癌的治愈率可达95%以上，因此早期诊断极为重要。乳腺癌基因的过表达或突变往往预示着癌细胞的增殖[1]，因此，高灵敏检测乳腺癌基因尤为重要[2]。

DNA电化学生物传感器因灵敏、快速、简便、不破坏测试样品、不受溶液颜色影响、便于微型化等优点，近年来被广泛用于临床医学、食品分析和环境监测等领域[3-5]。DNA电化学传感器可分为标记型和非标记型两种[6]。标记型DNA电化学传感器灵敏度高，缺点是在标记过程中，涉及合成、标记、分离和纯化等步骤，对DNA的活性可能产生影响。因此，非标记是DNA电化学传感器的发展趋势。常用的非标记DNA电化学传感的检测方法包括电流法、电位法、电容法和阻抗法。非标记电流法利用DNA碱基自身的电化学特性进行测定，但由于碱基的电位高，检测灵敏度受到限制；另一种是选择一类能与ssDNA和dsDNA相互作用的电化学活性物质作为电化学信号探针，对传感器进行测定，不同的电化学探针测定DNA获得的灵敏度不同。常见的电化学探针有阳离子金属络合物、小分子药物及有机染料[7-8]等。

碳纳米管是一类很重要的纳米材料，具有表面积高、中空、化学稳定和导电性良好等特点，可作为电极修饰物或信号载体[9]。近年来碳纳米管负载酶或纳米粒子的信号放大作用，提高了DNA检测的灵敏度[10-11]。金纳米粒子具有良好的生物相容性，可以作为固定DNA的良好载体。

图1 DNA电化学传感器制备及目标DNA检测的原理示意图Fig.1 Schematic representation of the preparation of electrochemical DNA biosensors and hybridization detection of breast cancer gene

本文以荷负电铁氰化钾电对([Fe(CN)6]3-/4-)、荷正电的六氨合钌([Ru(NH3)6]3+)及有机染料亚甲基蓝(MB)为电化学探针，构建了检测乳腺癌BRCA1基因片段的电化学传感器。首先将多壁碳纳米管和Nafion的混合液超声后修饰到金电极上，后利用电化学沉积法将金纳米沉积到修饰电极上，增大了金电极的表面积，提高了DNA的负载量。然后基于静电吸附作用，将乳腺癌BRCA1基因片段(乳腺癌ssDNA)固定到修饰电极上，制备乳腺癌DNA电化学传感器(图1)。选用3种不同的电化学探针，对乳腺癌目标DNA杂交前后进行定量检测。结果表明，3种电化学探针中，铁氰化钾平衡电对探针检测乳腺癌DNA的检出限最低，线性范围最宽；六氨合钌检测乳腺癌DNA的灵敏度最高。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660型电化学工作站(天津市兰力科电子高技术有限公司)。三电极系统：金电极或金纳米/多壁碳纳米管-Nafion/金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极。

多壁碳纳米管(深圳纳米港)；铁氰化钾和亚铁氰化钾(西安化学试剂厂)；亚甲基蓝(中国医药公司北京采购站)；氯化六氨合钌、Nafion和6-巯基-1-己醇(Sigma-Aldrich公司)；氯金酸(国药上海试剂厂)。所有乳腺癌基因片段DNA(上海生物工程有限公司)序列[12]如下:探针ssDNA:5’-GAG AAA CCC TAT GTA TGC TC-3’，互补目标DNA:5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TC-3’。单碱基错配DNA:5’-GAG CAT ACA TTG GGT TTC TC-3’，五碱基错配DNA:5’-GGG CAC ACA AAC CGTTTC TC-3’。

10 mmol/L PBS pH 7.0缓冲溶液为DNA储备液。5 mmol/L K3[Fe(CN)6]- 5 mmol/L K4[Fe(CN)6]溶液：用0.10 mol/L PBS(pH 7.4)-0.10 mol/L KCl配制。20 μmol/L亚甲基蓝(MB)溶液：用0.10 mol/L PBS(pH 7.0)缓冲溶液配制。50 μmol/L六氨合钌溶液([Ru(NH3)6]3+)：用10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4) 溶液配制。DNA序列在使用前经超速离心机离心5 min(8 000 r/min)，配成一定浓度的水溶液，在4 ℃冰箱中保存待用。实验用水为Millipore Milli-Q超纯水(大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 DNA传感器的制备

金电极预处理第一步参照文献[13]。第二步将2 μL 1 mg/mL的多壁碳纳米管和0.1%的Nafion-乙醇溶液混合，超声分散均匀后滴涂到预处理好的金电极表面，记作多壁碳纳米管-Nafion/金电极(MWCNT-Nafion/Au)；将MWCNT-Nafion/Au置于6 mmol/L氯金酸溶液中，在-200 mV恒电位下沉积80 s，获得金纳米/多壁碳纳米管-Nafion/金电极(GNPs/MWCNT-Nafion/Au)。第三步将5 μL 1.0 μmol/L乳腺癌ssDNA溶液滴涂在GNPs/MWCNT-Nafion/Au表面,4 ℃下固定12 h，然后用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超纯水分别冲洗，以除去未吸附固定的乳腺癌ssDNA。最后用1 mmol/L 6-巯基-1-己醇(MCH)封闭1 h，使DNA链的取向更加相对有序，减小非特异性吸附，提高杂交反应的效率。再用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超纯水分别冲洗，制备得到DNA传感器(ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au)。

1.3 目标乳腺癌DNA的分析测定

将5.0 μL目标乳腺癌DNA滴涂到DNA传感器表面，37 ℃杂交反应1.5 h后，用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超纯水冲洗，除去未参与特异性杂交反应的目标DNA。分别在5 mmol/L K3[Fe(CN)6] -5 mmol/L K4[Fe(CN)6]溶液、20 μmol/L MB溶液和50 μmol/L [Ru(NH3)6]3+溶液中进行循环伏安和差分脉冲伏安法研究。利用杂交前后电化学探针的电流差值(ΔI=ΔIdsDNA-ΔIssDNA)与目标乳腺癌DNA的浓度进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 修饰电极的SEM与电化学表征

将MWCNT-nafion/Au及GNPs/MWCNT-Nafion/Au进行扫描电镜观察。从SEM图(图2A)可以看出电极表面的MWCNT呈线状卷曲，均匀分布在电极表面。沉积金纳米后，表面分散有颗粒状的金纳米(图2B)，说明纳米金沉积成功。

图3 不同修饰电极的电化学阻抗图Fig.3 Electrochemical impedance spectra of different modified electrodesa.bare gold electrode;b.MWCNT-Nafion/Au;c.GNPs/MWCNT-Nafion/Au;d.ssDNA/GNPs/MWCNT-Nafion/Au;e.ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au;f.dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/ MWCNT-Nafion/Au；cssDNA=1.0 μmol/L,cdsDNA=1.0 nmol/L

将金电极和GNPs/MWCNT-Nafion修饰金电极在1.0 mol/L H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位范围在-0.2～1.6 V，扫速50 mV/s，测定0.9 V左右金的阴极峰峰面积(电量)，根据金表面电吸附氧形成单分子层AuO所需的双电层电荷系数(0.386 mC/cm2)[14]，可以算出电极的真实面积。根据还原峰面积计算得到金电极的真实面积为1.3×10-2cm2，修饰金电极的真实面积为2.3×10-2cm2，增加约1.8倍。说明GNPs/MWCNT-Nafion复合材料修饰明显增大了裸电极的比表面积。

图3为不同修饰电极的电化学阻抗曲线图。由图3可知，裸金电极(曲线a)的阻抗谱高频区出现了一非常小的半圆，说明其具有良好的导电性，电荷传递电阻Ret为201.2 Ω。电极表面修饰上多壁碳纳米管和Nafion(曲线b)后，Ret减小至114.6 Ω，说明MWCNT-Nafion具有良好的导电性。当沉积上纳米金时，曲线c几乎成为一条直线，Ret减小至30.6 Ω，表明纳米金粒子进一步促进了电子的转移。当修饰电极表面固定上乳腺癌ssDNA时，曲线d高频区的半圆明显增大，Ret为443.6 Ω，表明探针DNA成功地固定到修饰电极表面。用MCH封闭修饰电极空余的未结合位点，曲线e半圆进一步增大，Ret为687.0 Ω。当目标乳腺癌DNA通过碱基互补的方式杂交到电极表面上，曲线f高频区的半圆达到最大，其Ret为1 003.0 Ω，这是因为双链DNA的磷酸骨架比单链DNA排斥带负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-能力强。以上结果表明，乳腺癌ssDNA通过静电吸附作用固定在电极表面，构建的乳腺癌DNA传感器与目标DNA发生了杂交反应。

图4 不同电极的循环伏安曲线图Fig.4 Cyclic voltammograms of different modified electrodesa.bare gold electrode;b.MWCNT-Nafion/Au;c.GNPs/MWCNT-Nafion/Au;d.ssDNA/GNPs/MWCNT-Nafion/Au;e.dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au；cssDNA=1.0 μmol/L,cdsDNA=1.0 nmol/L

图5 不同浓度乳腺癌DNA在[Fe(CN)6]3-/4-探针中的微分脉冲伏安图Fig.5 Differential pulse voltammograms of the different concentrations of breast cancer gene in 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-c(from a to h)：0,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,100.0,500.0 nmol/L；insert:calibration curve of target breast cancer gene

图4为不同修饰电极的循环伏安曲线图，由图4可知，裸金电极具有良好的可逆性，峰电位差ΔE为80 mV(曲线a)。修饰上多壁碳纳米管和Nafion溶液后，峰电流明显增大，ΔE为98 mV(曲线b)。电化学沉积上金纳米时(曲线c)，峰电流继续增大，ΔE为79 mV。这是由于纳米金修饰电极后，有效增大了电极面积，促进了电子在溶液和电极之间的传递。当乳腺癌ssDNA固定到修饰电极上时(曲线d)，由于电极表面的DNA膜和DNA磷酸骨架上的负电荷，使得[Fe(CN)6]3-/4-在电极上的电子传递速率受到抑制，所以ΔE增大，峰电流减小。乳腺癌ssDNA与目标乳腺癌DNA杂交反应后(曲线e)，形成双链DNA结构，荷负电的磷酸骨架数量增多，进一步阻碍了荷负电的[Fe(CN)6]3-/4-向电极表面传递，ΔE进一步增大，峰电流继续减小。循环伏安法与阻抗法表征的结果一致，说明DNA传感器制备成功。

2.2 不同电化学探针在DNA传感器中的应用

为了获得较高的灵敏度，分别采用3种不同电化学探针(荷负电的[Fe(CN)6]3-/4-、荷正电的[Ru(NH3)6]3+和染料MB)作为检测液，对目标乳腺癌DNA进行了分析测定。

2.2.1电化学探针[Fe(CN)6]3-/4-[Fe(CN)6]3-/4-因其良好的电化学行为和可逆性，被广泛用于电极表征和电化学传感器的研究[15]。电极上固定的ssDNA荷负电磷酸骨架对荷负电的[Fe(CN)6]3-/4-探针有静电排斥作用，当ssDNA与目标DNA杂交反应后，双链DNA对[Fe(CN)6]3-/4-探针的排斥作用更大，引起电流减小，基于此原理，用[Fe(CN)6]3-/4-探针对目标乳腺癌DNA进行定量测定。

图5为不同浓度的目标乳腺癌DNA与电流的微分脉冲伏安曲线图。在优化的实验条件下，杂交前后的氧化峰电流变化值ΔI(μA)与目标乳腺癌DNA浓度(c，mol/L) 的对数logc在0.1～500.0 nmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为ΔI=16.34logc+174.12，相关系数为0.998 0，其检出限(S/N=3)为0.03 nmol/L。对1.0 nmol/L的目标乳腺癌DNA进行7次平行测定，相对标准偏差为3.6%。

利用电化学交流阻抗法考察了DNA电化学传感器与完全互补DNA序列、单碱基错配DNA序列和五碱基错配DNA序列杂交的电子传递阻抗变化情况。结果发现，电子传递阻抗变化值ΔRet分别为4 380、2 250、650 Ω。说明DNA传感器与完全互补序列结合后对[Fe(CN)6]3-/4-的阻碍作用最大，也表明该传感器能识别互补、单碱基错配和五碱基错配DNA序列，具有良好的选择性。

2.2.2电化学探针MB亚甲基蓝(MB)是具有芳香杂环结构的化合物，MB可以通过静电吸附作用与磷酸骨架相结合，也能够与鸟嘌呤(G)特异性结合。MB与单、双链DNA的静电吸附能力不同，可以选择性地识别单、双链DNA，常被用作电化学指示剂应用于DNA传感器的研究[16]。

考察了ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/金电极和dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/金电极在20 μmol/L MB溶液中的循环伏安行为。结果显示，当乳腺癌ssDNA与100 nmol/L目标乳腺癌DNA杂交后，MB的峰电流明显增大，这归因于MB与双链DNA之间强大的吸附作用，使得更多的MB被吸附到双链DNA上。表明MB可以用于目标乳腺癌DNA的测定。

图6 不同浓度乳腺癌DNA在MB探针中的微分脉冲伏安图Fig.6 Differential pulse voltammograms of the different concentrations of breast cancer gene in 20 μmol/L MBc(from a to g)：0,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0,500.0 nmol/L；insert:calibration curve of target breast cancer gene

图7 不同浓度乳腺癌DNA在[Ru(NH3)6]3+探针中的微分脉冲伏安图Fig.7 Differential pulse voltammograms of the different concentrations of breast cancer gene in 50.0 μmol/L MBc(from a to g):0,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0,500.0 nmol/L;insert:calibration curve of target breast cancer gene

在优化实验条件下，发现杂交前后MB的还原峰电流变化值ΔI(μA)与目标乳腺癌DNA浓度的对数在1.0～500.0 nmol/L 范围内呈良好的线性关系(图6)，其线性方程为ΔI= 17.80 logc+172.95，相关系数为0.996 0；检出限(S/N=3)为0.3 nmol/L，对1.0 nmol/L的目标DNA进行7次平行测定，相对标准偏差为3.9%。

2.2.3电化学探针[Ru(NH3)6]3+六氨合钌离子[Ru(NH3)6]3+是一种常用的电活性物质，与DNA骨架之间可以通过静电力相互结合[17-18]。本研究基于ssDNA和dsDNA对[Ru(NH3)6]3+吸附量的不同，通过检测电极表面吸附[Ru(NH3)6]3+的电流大小，对目标乳腺癌DNA进行分析检测。考察了ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au和dsDNA/ssDNA/MCH/GNPs/MWCNT-Nafion/Au传感器在除氧、扫速为50 mV/s的条件下，于10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.40)-50.0 μmol/L[Ru(NH3)6]3+溶液中的循环伏安行为。结果发现-0.2 V和-0.3 V出现了1对氧化还原峰，这是[Ru(NH3)6]3+的特征吸收峰。当电极上固定了带负电荷的DNA磷酸骨架，由于静电吸附作用，使得[Ru(NH3)6]3+吸附在电极上，出现了[Ru(NH3)6]3+的一对氧化还原峰。杂交反应后，由于双链荷负电吸附了更多[Ru(NH3)6]3+，使得电流增大。说明[Ru(NH3)6]3+探针可用于目标乳腺癌DNA的分析测定。

在优化实验条件下，研究了所制备的DNA电化学传感器对目标乳腺癌DNA样品的DPV响应(图7)。杂交前后[Ru(NH3)6]3+的还原峰电流变化值ΔI(μA)与目标乳腺癌DNA浓度的对数在1.0～500.0 nmol/L 范围内呈良好的线性关系，线性方程为ΔI= 19.57logc+196.48，相关系数为0.996 0；其检出限(S/N=3)为0.3 nmol/L，对1.0 nmol/L的目标DNA进行7次平行测定，相对标准偏差为4.2%。

3 结 论

本文基于3种不同的电化学探针对目标乳腺癌DNA电化学传感器进行了研究。结果发现，铁氰化钾平衡电对为探针时乳腺癌DNA的检出限最低，线性范围最宽。使用六氨合钌检测乳腺癌DNA的灵敏度高，但使用六氨合钌探针，实验必须在氮气保护下进行，且六氨合钌价格较贵，限制了该探针在DNA电化学传感器中的广泛应用。亚甲基蓝是染料，价格较六氨合钌低，但极易吸附在电极表面，使得冲洗和处理电极非常繁琐费时。

参考文献：

[1] Fackenthal J D,Olopade O I.Nat.Rev.Cancer，2007,7(12):937-948.

综上所述，留守生活不仅仅影响留守学生现在的心理健康，还对其人格的形成具有长远意义，良好的人格对人一生的意义至关重要。因此对于留守儿童的关注不仅应放在其生活、学习及心理健康上，更应关注其人格的培养，这样不仅有助于现阶段的心理健康，还能更好地帮助其健康成长。留守儿童的人格是否在留守前后有较大改变以及心理健康教育和各种训练对他们的人格有何影响，可进一步进行前瞻性的研究。

[2] Li T,Fan Q,Liu T,Zhua X L,Zhao J,Li G X.Biosens.Bioelectron.,2010,25(12):2686-2689.

[3] Hu Y H,Xu X Q,Liu Q H,Wang L,Lin Z Y,Chen G N.Anal.Chem.,2014,86(17):8785-8790.

[4] Zhou Y,Li B,Wang M,Yang Z,Yin H,Ai S.Anal.Chim.Acta,2014,840(1):28-32.

[5] Xu S C,Wen J N,Jiang N,Li J,Wang C F,Dong K,Zhang Y Y.J.Instrum.Anal.(许世超，温俊男，江南，李娇，王才富，董凯，张忆一.分析测试学报)，2017，36(4):555-559.

[6] Qi H L,Zhang C X.Prog.Chem.(漆红兰,张成孝.化学进展),2005,17(5):911-915.

[7] Wang Q X,Yuan X L,Jiao K,Xie J K,Zhang B.Prog.Chem.(汪庆祥,袁显龙,焦奎,谢江坤,张波.化学进展),2007,19(6):1007-1015.

[8] Zhang J,Wan Y,Wang L H,Song S P,Fan C H.Prog.Chem.(张炯,万莹,王丽华,宋世平,樊春海.化学进展),2007,19(10):1576-1584.

[9] Cheng G F,Zhao J,Tu Y H,He P H,Fang Y Z.Anal.Chim.Acta，2005,533(1):11-16.

[11] Li J,Ng H T,Cassell A,Fan W,Chen H,Ye Q,Koehne J,Han J,Meyyappan M.NanoLett.，2003,3(5):597-602.

[12] Yang Y C,Li C,Yin L,Liu M Y,Wang Z X,Shu Y Q,Li G X.ACSAppl.Mater.Interfaces,2014,6(10):7579-7584.

[13] Li X X,Qi H L,Shen L H,Gao Q,Zhang C X.Electroanalysis,2008,20(13):1475-1482.

[14] Tremiliosi-Filho G,Dall’Antonia L H,Jerkiewicz G.J.Electroanal.Chem.,1997,422(1/2):149-159

[15] Du F J,Hu X Q,Song K,Li X X.TransducerandMicrosystemTechnologies(杜芳静,胡晓琴,宋柯,李晓霞.传感器与微系统),2015,34(1):60-62.

[16] Luo X W,Du F J,Wu Y,Gao L J,Li X X.Chin.J.Anal.Chem.(罗贤文,杜芳静,吴烨,高楼军,李晓霞.分析化学),2013,41(11):1664-1668.

[17] Liu P,Liu X Q,Wang S M,Jin Z G.J.Instrum.Anal.(刘萍,刘晓琴,王书民,金振国.分析测试学报),2011,30(7):739-744.

[18] Shangguan L,Qi H L,Ling C.ActaChim.Sin.(上官莉,漆红兰,凌晨.化学学报),2011,69(18):2196-2200.