慢性乙型肝炎患者CD4+T细胞Foxp3基因甲基化状态的研究

张君　李风　范玉琛　赵静　李海铭　刘馨远　田明明　高帅　于岩波　王凯

250012 济南，山东大学齐鲁医院肝病科(张君、李风、范玉琛、赵静、李海铭、刘馨远、田明明、高帅、王凯)，消化内科(于岩波)；250012 济南，山东大学肝病研究所(范玉琛、王凯)

全球大约有2.57亿人感染了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)[1]，HBV感染的临床结局主要取决于病毒和宿主之间的相互作用[2]。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是机体重要的免疫调节细胞，与HBV感染慢性化有关[3-5]。叉头框转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)是Tregs的特异性转录因子，在Treg的发育、分化和功能维持等方面发挥重要作用[6]。研究表明，Foxp3基因的甲基化可调节Foxp3的基因表达，参与Treg细胞功能[7]。因此，本研究推测Foxp3基因甲基化状态参与了慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的发病过程。本研究拟阐明外周血CD4+T细胞Foxp3基因甲基化状态在慢性乙型肝炎患者中的表达规律。

1　材料与方法

1.1研究对象本研究选择2014年9月至2015年1月在山东大学齐鲁医院就诊的59例CHB患者，其中乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性患者34例，HBeAg阴性患者25例，同时选择22例健康体检者作为对照(HCs)。根据2015年《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》，纳入标准为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和HBV DNA阳性6个月以上，血清HBeAg阳性或者阴性，丙氨酸氨基转移酶(ALT)持续或反复升高，或有肝组织学病变[8]。排除标准包括肿瘤病史、伴随慢性丙型肝炎或人类免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、妊娠、糖尿病、药物性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及其他慢性肝病的病因。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，研究对象或家属知情同意。

1.2外周血CD4+T细胞的分离分别抽取所有研究对象各20 ml外周静脉血，使用淋巴细胞分离液(瑞典GE医疗集团)经密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMCs)。再利用磁珠(德国美天旎公司)分选出CD4+T细胞，并通过流式细胞术证实了CD4+T细胞的纯度高于90%。

1.3流式细胞术分析将上述密度梯度离心所得到的PBMCs用抗人单克隆抗体CD4-PE和CD25-APC、FOXP3-FITC(美国eBioscience公司)进行染色。根据细胞固定/破膜试剂盒(美国eBioscience公司)说明书步骤对细胞进行洗涤，固定，破膜，染色。然后使用FACS Calibur(美国BD公司)分析细胞。最后用FlowJo 软件(美国Tree Star Inc公司)计算出CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例。

1.4实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)严格按照说明书用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)从CD4+T细胞中提取总RNA，并将RNA逆转录为cDNA。FOXP3基因的RT-qPCR上下游引物分别为5’-CAGCACATTCCCAGAGTTCCTC-3’和5’-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC-3’。β-Actin作为内参基因，其上下游引物分别为5’-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’和5’-CTTCATG AGGTAGTCAGTCAGGTC-3’。RT-qPCR反应体系为20 μl:1 μl的cDNA、上下游引物各0.4 μl、10 μl SYBR@ PremixExTMTaq (日本TaKaRa公司)以及8.2 μl ddH2O。反应条件: 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40 次；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。β-Actin 作为内参计算目的基因mRNA相对表达水平。

1.5蛋白质印迹从CD4+T细胞中提取总蛋白，再用BCA测定试剂盒(上海碧云天公司)测定蛋白浓度。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后再转移到聚乙二烯二氟化物膜上，并在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中进行封闭,然后用兔抗人Foxp3多克隆抗体(1∶2 000,英国Abcam 公司)孵化，4 ℃过夜，随后用二抗羊抗兔抗体(1∶2 000，武汉博士德公司)在室温下孵育1 h，通过增强化学发光检测系统Image Quant LAS 4000 mini(美国通用电气公司)使蛋白质条带显影，并使用Quantity One软件(美国伯乐公司)进行蛋白定量。

1.6甲基化特异性聚合酶链反应用Trizol试剂从CD4+T细胞中提取基因组DNA。按照EZ DNA甲基化修饰试剂盒(美国ZYMO RESEARCH公司)说明书对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰。采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测Foxp3甲基化状态。其MSP的引物序列见表1[9]。总反应体系为25 μl：1 μl修饰后的DNA和上下游引物各0.5 μl，10.5 μl无核酸酶水，12.5 μl Premix Taq(美国Zymo research公司)。反应条件为：95 ℃预变性15 min； 95 ℃变性1 min, 60 ℃退火90 s和72 ℃ 延伸1 min, 35个循环；最后72 ℃ 延伸10 min。将7 μl PCR产物加入到2%琼脂糖凝胶孔中电泳，在紫外灯下曝光，使用凝胶电泳图像分析系统采集图像并对结果进行分析。

1.7统计学方法所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析。定量数据以中位数(25%，75%)表示。分类数据以数字(%)表示。采用t检验或Mann-Whitney U检验来比较定量变量，卡方检验用于比较分类变量,使用spearman等级相关性检验来评估相关性。所有检验均为双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

注：CHB，慢性乙型肝炎; HC，健康对照组图1　不同研究人群之间外周血CD4+ T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例以及FOXP3表达的比较；CHB患者外周血CD4+ T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例和 FOXP3表达水平之间的关系Note: CHB, chronic hepatitis B; HC, healthy controlsFig.1　The comparison of frequency of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells and Foxp3 expression in peripheral CD4+ T cells in different populations. The percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells was associated with the Foxp3 mRNA level in CD4+ T cells of CHB patients

2　结果

2.1CD4+T细胞中CD4+CD25+FOXP3+Tregs的比例HBeAg阳性患者CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例均明显高于HBeAg阴性患者和HC[5.30%(3.73%，7.98%) vs 3.90%(3.10%，4.90%)，P=0.012；5.30%(3.73%，7.98%) vs 3.6%(2.75%，4.3%)，P=0.001图1A]，然而HBeAg阴性患者与HC之间差异无统计学意义[3.90%(3.10%，4.90%) vs 3.6%(2.75%，4.3%)，P=0.263图1 A]。

表1　用于MSP的FOXP3基因的引物序列

注：缩写：enc=增强子;F=下游引物; Meth=甲基化; R=下游引物; Unmeth=非甲基化的

Note：Abbreviations: enc=enhancer;F=forward; Meth=methylated; R=reverse; Unmeth=unmethylated

注：Foxp3enc：Foxp3增强子; Foxp3cpg：Foxp3 CpG岛; HC，健康对照组; M：甲基化; U：未甲基化; bp：碱基对图2　不同研究人群之间 Foxp3enc和Foxp3cpg位点上的甲基化状态，CHB患者CD4+ T细胞中CD4+CD25+Foxp3+ Tregs比例及Foxp3 mRNA水平与其基因甲基化状态之间的关系Note: Foxp3enc, Foxp3 enhancer; Foxp3cpg, Foxp3 CpG island; HC, healthy control; M, methylated; U, unmethylated; bp, base pairsFig.2　The methylation status of Foxp3 at enhancer and CpG island sites in different populations.，and the relationship between the percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory cells and Foxp3 mRNA level with the methylation status of Foxp3 at enhancer and CpG island sites in CD4+ T cells of CHB patients

2.2CD4+T细胞中Foxp3的表达与CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例的关系与HBeAg阴性CHB患者及HC相比，HBeAg阳性CHB患者CD4+T细胞中Foxp3 mRNA水平明显升高[0.0046(0.0040,0.0061) vs 0.0024(0.0022, 0.0041)，P=0.021；0.0046(0.0040,0.0061) vs 0.0017(0.0015,0.0030)，P=0.000，图1B]，HBeAg阴性CHB患者也明显高于HC[0.0024(0.0022,0.0041) vs 0.0017(0.0015,0.0030)，P=0.032图1B]；Foxp3蛋白在HBeAg阳性CHB患者中也有明显的上调[0.73(0.66,0.93)vs 0.49(0.41,0.66)，P=0.005；0.73(0.66,0.93)vs 0.45(0.37,0.55)，P=0.000，图1C和1D]，在HBeAg阴性CHB患者与HC之间无明显差异[0.49(0.41,0.66)vs 0.45(0.37,0.55)，P=0.536，图1C和1D]。此外，通过spearman等级相关性检验发现CHB患者CD4+T细胞中Foxp3的表达水平与CD4+CD25+FOXP3+ Tregs细胞的比例呈正相关，即随着Foxp3基因表达的升高，CD4+CD25+FOXP3+Tregs比例也增加(r=0.991，P=0.000,图1E)。

图3　慢乙肝患者HBV DNA水平与CD4+T细胞中Tregs比例,Foxp3 mRNA水平的关系Fig.3　Serum HBV DNA load was associated with the percentage of regulatory T cells and Foxp3 mRNA levels in CD4+ T cells of CHB patients

2.3CD4+T细胞中Foxp3的甲基化状态与CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及Foxp3mRNA水平之间的关系通过对Foxp3基因增强子(Foxp3enc)和CpG岛(Foxp3cpg)位点上甲基化结果的分析，发现HBeAg阳性CHB患者Foxp3enc甲基化频率显著低于HC组35.3%[(12/22)vs 72.7%(16/22)，χ2=7.487，P=0.006，图2B]，然而，HBeAg阴性患者Foxp3enc甲基化频率与HBeAg阳性患者以及HC之间差异无统计学意义(52.0% vs 35,3%，P=0.199; 52.0% vs 72.7%，P=0.145，图2B)。Foxp3enc甲基化组的Foxp3 mRNA水平和CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例均显著低于非甲基化组[0.0027(0.0016，0.0038) vs 0.0039(0.0021,0.0081)，P=0.023，图2C；3.80(2.40，5.30) vs 6.80(4.60,8.75)，P=0.014，图2D]。HBeAg阳性CHB患者中Foxp3cpg甲基化频率也显著低于HC[32.4%(11/34)vs 63.6%(14/22)，χ2=5.290，P=0.021，图2E]，而HBeAg阴性患者Foxp3cpg甲基化频率与HBeAg阳性患者以及HC之间差异均无统计学意义(44.0% vs 32.4%，P=0.361；44.0% vs 63.6%，P=0.179，图2E)，Foxp3cpg未甲基化组Foxp3 mRNA水平和CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例均显著高于甲基化组[0.0026(0.0014,0.0037)对0.0041(0.0019,0.0080)，P=0.032，图2F；3.90(2.40，5.00) vs 6.40[4.60,8.35)，P=0.018，图2G]。Foxp3基因甲基化的典型MSP结果如图2A所示。

2.4CD4+CD25+Foxp3+Treg比例以及FOXP3基因的表达和甲基化状态与CHB患者临床指标的关系59例CHB患者中，有35例患者血清HBV DNA载量> 1000 IU/ml,24例血清HBV DNA 载量< 1000 IU/ml。HBV DNA高载量(HBV DNA载量> 1000 IU/ml)的患者CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例和Foxp3 mRNA水平显著高于HBV DNA低载量(HBV DNA 载量< 1000 IU/ml)的患者[5.00%(3.80%, 7.60%) vs 3.70%(2.95%, 5.08%),P=0.019; 0.0037(0.0024, 0.0080) vs 0.0024(0.0017, 0.0038),P=0.045] (图3 A和3B)。HBV DNA高载量的患者FOXP3的甲基化频率与HBV DNA低载量患者无明显差别(Foxp3enc 34.3% vs 56.5%,P=0.129;Foxp3cpg 31.4% vs 45.8%，P=0.261)。

3　讨论

Tregs是机体最重要的免疫调节细胞，在乙型肝炎的免疫调节中发挥重要作用[3-5]。研究表明，CHB患者外周血Tregs细胞比例的增加与HBV感染免疫耐受相关，参与了HBV感染的慢性化[4-5]。Foxp3是Tregs的特异性转录因子，在Tregs发育、分化和功能维持中起到决定性作用[6]。本研究发现CHB患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs的比例以及Foxp3基因的表达水平均显著高于正常对照组，这与之前的研究结果一致[4-5]，此外，通过spearman等级相关性检验发现CHB患者CD4+T细胞中Foxp3表达水平与CD4+CD25+FOXP3+ Tregs比例呈正相关，即随着Foxp表达的升高，Tregs比例也增加,与之前的研究结果一致[6]，提示Foxp3基因表达水平的上调促进了CD4+CD25+Foxp3+ Tregs比例的增加，参与了HBV感染的发生发展过程。

DNA甲基化广泛分布于人类基因组中，其主要发生在与鸟嘌呤相邻的胞嘧啶(CpG二核苷酸)上，基因启动子区域的DNA甲基化通常与基因沉默以及基因功能丧失有关[10]。Foxp3基因增强子区域存在一个Treg特异性去甲基化区域(treg-specific demethylated region, TSDR)，该区域的甲基化状态与稳定Foxp3的表达以及维持CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的功能密切相关[7]。Syed等[11]通过对花生过敏人群的脱敏口服免疫治疗研究，发现与免疫不耐受患者相比，免疫耐受患者Foxp3启动子区甲基化水平更低，Treg抑制功能更强；当患者停止免疫治疗并再次对花生过敏时，Foxp3启动子区域的甲基化水平相应增加，表明了Foxp3基因甲基化状态可能与机体免疫耐受相关。在本研究中，我们通过MSP检测CHB患者和HC组Foxp3enc以及Foxp3cpg位点的甲基化状态，发现CHB患者Foxp3enc和Foxp3cpg位点的甲基化频率均明显低于健康对照，我们还发现Foxp3enc和Foxp3cpg位点甲基化组Foxp3的表达水平及CD4+CD25+Foxp3+ Tregs细胞的比例均明显低于未甲基化组。这些结果提示，在CHB患者CD4+T细胞中Foxp3基因存在异常去甲基化，可能引起了Foxp3表达升高，进而引起CD4+25+Foxp3+Tregs比例的增加，参与机体对HBV感染免疫耐受机制而导致病程的慢性化。

此外，我们还发现血清HBeAg阳性、HBV DNA高载量(HBV DNA>1000 IU/ml)与CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及FOXP3表达升高有关，这些结果与之前的研究结果一致[5]，提示CD4+CD25+Foxp3+Tregs可能与HBV病毒复制和持续存在有关。我们还发现与HBeAg阴性和HBVDNA低载量患者相比，血清HBeAg阳性或HBV DNA高载量患者Foxp3的甲基化频率均降低，但无统计学意义，这可能是由于研究样本量相对较小和(或)MSP为定性检测有关。同时，本研究为探索性研究，对Foxp3基因甲基化如何影响Foxp3表达的分子机制，需要进一步研究。

综上所述，本研究发现CHB患者CD4+T细胞中Foxp3基因存在异常去甲基化，与Tregs细胞比例和Fxop3表达有关，共同参与了慢性乙型肝炎的免疫过程。

利益冲突:无

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