儿童原发性EB病毒感染caspase-3/6水平与肝损害的相关性研究

温正旺　陈益平　徐志伟　石海矾　狄军波　陈均亚　陈洁　蔡晓红

325000 温州医科大学附属第二医院儿童感染科(温正旺、陈益平、徐志伟、石海矾、狄军波、陈均亚、陈洁)，儿童呼吸科(蔡晓红)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是非嗜肝病毒感染引起儿童肝损害的常见病原体，原发性急性EBV感染可导致82%的患儿出现肝功能损伤[1]，大部分患儿的症状会在治疗1周内减退[2]。目前对EBV感染导致肝功能损伤的机制尚未完全明确。探索EBV感染后机体内与肝功能损害分子的表达情况，将为EBV感染导致肝功能损伤的防治提供新的思路和策略，有助于阐明EBV感染诱导肝功能损伤的内在分子机制。Caspase3/6是导致肝细胞凋亡的主要分子蛋白，但是否与原发性EBV感染导致的肝功能损伤存在相关性，目前尚未明确。本研究通过收集患儿肝功能数据，并采用ELISA法检测患儿血液中肝细胞损伤相关分子蛋白的表达，探索原发性EBV感染肝功能损害与caspase3/6表达变化的相关性及其临床意义。

1　材料与方法

1.1研究对象收集2016年7月至2017年6月在温州医科大学附属第二医院住院治疗的原发性EBV感染患儿249例，EBV-IgM检测都为阳性，其中伴有肝功能损伤的168例为肝功能异常组，分别检测其急性期及恢复期实验室指标，恢复期抽血时间为住院治疗第7天，肝功能正常的81例为肝功能正常组，年龄都在1周岁到14周岁之间；肝功能异常组按年龄再分为4个亚组，包括幼儿组(1到3周岁)37例、学龄前组(3周岁到7周岁)50例、学龄组(7周岁到10周岁)36例、青少年组(10周岁到14周岁)45例。收集相关的肝功能数据：AST、ALT、GGT、TBLL、DBLL。标本采集获得患者或家属知情同意，本研究通过温州医科大学附属第二医院伦理委员会审核同意。

1.2ELISA方法检测血清caspase-3和caspase-6蛋白的表达水平Caspase-3和caspase-6 ELISA试剂盒为美国PeproTech公司生产；抗Caspase-3和caspase-6抗体购自英国abcom公司。取caspase-3和caspase-6酶联免疫试剂盒，室温下静置30 min，每孔加50 μl标准样品或待测样品，留两孔为空白对照孔；塑料薄膜覆盖微孔板，孵育2 h；洗板4次，反转酶标板，拍干各孔剩余的洗涤液；每孔加50 μl生物素标记的抗caspase-3和caspase-6抗体，塑料膜封板，孵育2 h；洗板4次，反转酶标板，拍干各孔剩余的洗涤液；每孔依次序加入显色剂A和B，避光室温孵育30 min；加入反应终止液100 μl，自动酶标仪于 450 nm处测定各孔的光密度(optical density，OD)值；以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品所测OD值确定其浓度。

2　结果

2.1肝功能异常组急性期和恢复期各项肝功能指标比较肝功能异常组中急性期和恢复期进行比较ALT差异具有显著性(F=122.4，P<0.001)，其余差异均无统计学意义(见表1)。

2.2肝功能异常组中各年龄分组间ALT差异比较

肝功能异常组按年龄分为4个亚组，其中仅青少年组ALT与其他各组比较差异具有统计学意义(F=143.4，P<0.001)，余指标在各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

2.3肝功能异常组和肝功能正常组间caspase-3/6比较以及肝功能异常组急性期和恢复期caspase-3/6比较肝功能异常组caspase-3和caspase-6的表达水平明显高于肝功能正常组，差异具有统计学意义(F=153.4,P<0.001,F=210.1，P<0.001)(见表3)。肝功能异常组中急性期caspase-3和caspase-6的表达水平明显高于恢复期，差异具有统计学意义(F=133.7,P<0.001,F=160.6，P<0.001)(见表3)。

2.4肝功能异常组中各年龄组间caspase-3/6比较肝功能异常组中按年龄分4个亚组，只有青少年组的caspase-3和caspase-6与其他组的比较差异具有统计学意义(F=152.1,P<0.001；F=122.9，P<0.001),余各组之间的caspase-3和caspase-6两两比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表1　肝功能异常组中急性期与恢复期ALT、AST、TBLL、GGT和DBLL的统计比较

表2　肝功能异常组中幼儿组、学龄前组、学龄组和青少年ALT、AST、TBLL、GGT和DBLL的统计比较

注：青少年组#P<0.05vs 幼儿组;*P<0.05vs 学龄前组;▲P<0.05vs 学龄期;其余P>0.05

Note:#P<0.05 adolescent group vs. young clindren group;*P<0.05 adolescent group vs. preschool group;△P<0.05 adolescent group vs. shcool age goup;P>0.05 for all the other comparisons

表3　肝功能异常组中caspase-3和caspase-6的表达水平的比较和急性期caspase-3和caspase-6的表达水平比较

2.5肝功能异常组急性期和恢复期caspase-3/6与ALT相关性分析肝功能异常组中急性期caspase-3和caspase-6的表达水平与ALT存在线性相关(r=0.982，P<0.001，r=0.965，P<0.001)(见图1)。

3　讨论

EBV属于疱疹病毒4型，是临床上导致儿童肝功能损伤的常见非嗜肝病毒。肝功能损害是原发性EBV感染最常见的并发症，但EBV感染如何诱导肝功能的损伤，其分子机制目前尚未完全明确。最近的国内研究提示EBV感染与乙型肝炎病毒感染导致的肝功能损伤存在相似性甚至可能通过B淋巴细胞群存在协同作用[3]；Zekri[4]在研究丙肝患者时发现，如果合并有EBV活动性感染，患者的病情会更重，肝功能呈现进行性升高；在2000年甚至更早已有研究提示EBV感染可以通过诱发与机体免疫能力相关的因子从而导致机体各脏器功能的损伤，脏器的损伤主要表现为细胞的凋亡[5]。

表4　肝功能异常组中幼儿组、学龄前组、学龄组和青少年caspase-3和caspase-6的表达水平比较

注：青少年组#P<0.001vs 幼儿组;*P<0.001vs 学龄前组;▲P<0.001 vs 学龄期；余P>0.05

Notes.#P<0.001 adolescent group vs. young children group;*P<0.001 adolescent group vs. preschool group;▲P<0.001 adolescent group vs. school age group;P>0.05 for all the other comparisons

图1　肝功能异常组急性期ALT与caspase-3/6的相关性分析Fig.1　The analysis of correlation between ALT and caspase-3/6 of liver fonction abnormal group

Caspase-6与caspase-3是细胞凋亡发生发展的关键分子，是绝大多数凋亡信号通路的共同调节因子，将胞外凋亡刺激转化成胞内凋亡级联反应，通常以酶原无活性的形式存在，在受到相关凋亡信号刺激后会被激活，通过降解蛋白分子的底物,从而诱导细胞凋亡；其中caspase-3还能通过水解胞内的细胞生存蛋白，进而诱导细胞的凋亡。动物研究文献提示肝炎患者中的肝细胞损伤多数表现为凋亡形式，且和caspase系列分子依赖的肝细胞凋亡密切相关，其中 caspase-3和caspase-6作用最为明显[6]，如甲肝、乙肝的患者血清中caspase-3/6的表达水平明显升高[7-8]，Masuoka[9]甚至通过caspase抑制剂来治疗丙肝并取得一定临床效果，在丙型肝炎肝功能损伤的机制研究中还发现caspase-6可以诱导JNK(c-Jun氨基末端激酶,c-Jun N-terminal kinase)的激活从而导致肝功能损伤[10]；但caspase3/6与EBV感染导致的肝功能损害是否存在相关性，目前尚未明确。

本研究发现，原发性EBV感染患儿血清中 caspase-3和caspase-6的表达水平明显上升，且肝功能异常组中ALT、caspase-3和caspase-6的表达水平明显高于肝功能正常组。既往在对丙肝的研究提示，肝炎患者中caspase-3和caspase-6表达水平的上升可直接诱导细胞的凋亡，导致肝功能的损伤，而采用caspase的抑制剂后，caspase-3和caspase-6表达下降，部分患者肝功能恢复正常。在肝功能异常组患儿中，急性期患儿的caspase-3/6以及ALT表达水平明显高于恢复期患儿，通过相关性分析发现当EBV感染后，急性期caspase3/6的表达与ALT的升高存在线性相关，提示原发性EBV感染所致肝功能的损伤与caspase3/6之间存在密切的内部联系。同时根据年龄分组，青少年组的caspase-3、caspase-6以及ALT表达水平明显高于其他3组，与中国香港儿童EBV感染导致肝功能损伤的研究中发现的随着年龄的增长肝功能的损害越明显的结果一致[11]。

因此，caspase-3/6的高表达与儿童原发性EBV感染所致的肝功能损害存在密切相关，同时ALT的升高与caspase-3/6的表达水平存在线性相关。

利益冲突:无

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