金黄连口服液对鸡呼吸道致病菌的抑菌作用研究

2018-04-16李瑞娟王小娜

今日畜牧兽医 2018年3期

关键词：嗜血鱼腥草连翘

李瑞娟，梁娜，冯芳，王小娜

（河北新华科极兽药集团有限公司，河北石家庄051430）

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1供试菌珠：鸡源性大肠杆菌标准菌种（O78）、副鸡嗜血杆菌，均购自中国兽医药品监察所；鸡毒支原体标准株S6（华南农业大学兽医学院）

1.1.2药品与试剂：金黄连口服液（河北新华科极兽药集团），由连翘、蒲公英、黄芩、金银花、板蓝根，购自安国药材批发市场；鱼腥草口服液（河北新华科极兽药集团）；营养琼脂（北京陆桥技术有限公司）；营养肉汤（北京陆桥技术有限公司）。

1.1.3仪器与设备：恒温培养箱（上海一恒科技仪器有限公司）、超净工作台（苏州苏净集团空气技术有限公司）等。

1.2　方法

1.2.1金黄连口服液的制备

由连翘、蒲公英、黄芩、金银花、板蓝根5种中药组成，连翘蒸馏提取挥发性物质，收集挥发性物质，备用；蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与其余蒲公英等四味加水煎煮1.5h，煎液滤过，滤液备用；药渣加水再煎煮1.0h，煎液滤过，滤液与上述两种水溶液合并，减压浓缩至一定体积，冷至40℃时加入乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，静置12h，滤取上清液，残渣加75%乙醇适量，搅匀，静置12h，滤过，合并乙醇液，回收乙醇至无醇味，加入连翘蒸馏液再加水制成，分装，置于4℃冰箱保存，备用。

1.2.2菌种准备

大肠杆菌O78、副鸡嗜血杆菌，将试验菌种分别接种于普通营养琼脂及鸡血清肉汤琼脂培养基，37℃培养18h，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养典型菌落于3mL生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。

鸡毒支原体S6株，将适量改良Frey氏培养液加入冷冻保存的菌种中，使冻干菌种复水。混匀后将混合物移植于5mL改良Frey氏液体培养基中，置于37℃5%～10%CO2和相对湿度为80%～90%的培养箱中培养。4～5d后培养基颜色变橙黄色或黄色，再传2代，测定颜色变化单位（108ccu/mL）并稀释至104ccu/mL作为本试验用菌液。

1.2.3药物敏感性试验

先于无菌平皿内加入20mL适宜的琼脂作底层，再用培养16～18h的目标菌液2mL与18mL的适宜琼脂混合均匀作上层，凝固后用直径为1cm的打孔器在培养基上等距离打孔6个，孔径大小、深度保持均匀，于孔中加满浓度为1g/mL的供试药液，置于37℃恒温培养箱中培养24h，（鸡毒支原体标准株S6、副鸡嗜血杆菌需封闭培养皿置于37℃含5%～10%CO2培养箱培养7～10d）测量抑菌圈直径，每种药液做3次重复，求平均值，每种菌均按照此方法进行试验。

抑菌结果判定方法：抑菌效果按《中药药理学》中的标准判定，抑菌直径＞20mm 为极敏记为（++++），15～19mm 为高敏，记为（+++）；10～14mm 为中敏，记为（++）；10mm 以下为低敏，记为（+）；“—”表示无抑菌作用。

1.2.4药物最小抑菌浓度（MIC）试验

取13×100mm灭菌试管11支并编号，每管加入无菌肉汤培养基2mL，然后于第1管中加入受试中药口服液2mL，混匀后取出2mL加入第2管中，以此类推，直到第9管中取出2mL弃去，第10管不加药液作阳性对照，第11管加入受试药液2mL，混匀后取2mL弃去，不加细菌作阴性对照。然后向3个组的两种药液的每个稀释度分别加入大肠杆菌O78、鸡毒支原体标准株S6、副鸡嗜血杆菌悬液0.1mL，摇匀，放入37℃恒温培养箱中培养24h，第 1～9 管药物浓度分别为 500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9、2.0mg/mL。以不发生混浊变化的最高药物稀释倍数为该药物的最低药物浓度为最小抑菌浓度（MIC），根据MIC值来评价中药的体外抑菌活性[1-3]。

2　结果

2.1　金黄连口服液对各试验菌株的抑菌圈直径的影响

金黄连口服液对引起鸡呼吸道疾病3种主要致病菌的抑菌效果见表2-1。结果显示，金黄连口服液对大肠杆菌O78型、副鸡嗜血杆菌、鸡毒支原体标准株S6株均表现出中等强度的抑菌活性，其抑菌直径分别为13.1mm、12.6mm、14.3mm，优于对照药物鱼腥草口服液（10.4mm、9.2mm、10.5mm）的抑制效果。表明，金黄连口服液对多种鸡呼吸道致病菌有一定程度的抵抗作用。

2.2　金黄连口服液的最小抑菌浓度测定结果

金黄连口服液最小抑菌浓度测定结果见表2-2。结果显示，金黄连口服液对大肠杆菌O78型、副鸡嗜血杆菌、鸡毒支原体标准株 S6的最小抑菌浓度 MIC值为 62.5mg/mL、125.0mg/mL、62.50mg/mL，较鱼腥草口服液（250.0mg/mL、125.0mg/mL、125.0mg/mL）作用明显。

3　分析与讨论

大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌等细菌为临床上常见致病菌，将金黄连口服液和鱼腥草口服液对致病菌进行抑菌活性研究对防治由这些细菌引起的感染具有重要意义。本试验通过采用药物敏感性试验的打孔法及最小抑菌浓度试验的试管二倍稀释法研究了金黄连口服液的体外抑菌作用。结果显示，金黄连口服液对大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、支原体均表现出一定的抑制作用，且抑制效果强于鱼腥草口服液对照组，这与田乐，杨红文等的报道结果相似[4-5]。表明，金黄连口服液可作为一种良好的临床抗菌药，具有较强的产品开发价值。

据报道，金黄连口服液方剂中各味药均具有明显的抗菌作用，君药连翘中的有效成分异连翘酯苷和连翘酯苷均有较强的抑菌能力，是连翘中极有前景的植物抗菌活性成分，对多种革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有明显的抑制作用。臣药蒲公英具有广谱抑菌活性，采用微量肉汤稀释法进行体外的抑菌实验研究，发现蒲公英对葡萄球菌属细菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌、肠球菌、肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌等常见临床分离细菌有明显的抗菌活性。体外研究发现，黄芩生品及炮制品对痢疾杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌有效。佐药金银花为作用较强的广谱抗菌中药，对金黄色葡萄糖球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌和变形杆菌等有抑菌作用。板蓝根对革兰阳性和阴性杆菌亦有一定的抑制作用，其抑菌的有效成分为色胺酮和一些化学结构尚未阐明的吲哚类衍生物[6-8]。