一起商品肉鸡传染性囊病病毒大肠杆菌混合感染的诊治

孙月萍, 牟泽华, 刘文华

(青岛农业大学动物医学院, 山东 青岛266109)

随着商品肉鸡养殖集约化程度的提高,大部分规模化肉鸡养殖场的免疫程序比较完善。 病毒病的大规模暴发鲜有发生。 最近某商品肉鸡养殖场出现23 日龄肉鸡的急性死亡,病鸡剖检可见腔上囊肿胀,有的腔上囊底部出血,气囊浑浊,心包积液,绝大部分鸡可见肝、脾肿大,个别鸡出现腿肌出血病变,初步怀疑为细菌和病毒的混合感染。 分别通过细菌学和病毒学两个方面的鉴定,判定该起疫情为传染性囊病病毒与大肠杆菌混合感染所致。 检测过程及治疗情况介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 检测样品为某商品肉鸡养殖场送检的大批死亡或濒死的23 日龄肉鸡。 试验所用培养基为青岛海博生物技术公司产品;药敏纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品;PCR 试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品;大肠杆菌单因子标准阳性血清购自中国兽医药品监察所; 质控菌株ATCC25922,购自中国药品生物制品检定所。

1.2 细菌的分离鉴定

1.2.1 细菌的分离培养 无菌取发病鸡肝、脾分别划线接种普通培养基、S. S. 培养基和大肠杆菌显色培养基进行37 ℃培养。 将生长的单菌落进一步接种血琼脂平板培养观察。

1.2.2 大肠杆菌的PCR 鉴定 常规分离培养不能完全确诊是大肠杆菌,因此,又对分离细菌进行了PCR 鉴定。 采用煮沸法提取待检细菌DNA 作为PCR 扩增模板[1]。 根据文献报道的大肠杆菌的usp A 基因PCR 鉴定方法[2],利用上游引物5′ -CCGATACGCTGCCAATCAGT -3′和下游引物5′ -ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3′按常规PCR 扩增体系和循环对待检菌进行了PCR 扩增。

1.2.3 血清型鉴定 用购买的大肠杆菌单因子标准阳性血清与高压处理过的分离菌株的菌体抗原进行凝集反应[3]。

1.2.4 药敏试验 将鉴定的大肠杆菌按常规方法进行18 种药物的纸片法药敏试验,同时设大肠杆菌质控菌株ATCC25922 作为对照,根据美国NCCLS药敏试验标准判定药物的敏感性。

1.3 病毒的分离鉴定 根据临床症状和剖检病变,怀疑有传染性囊病病毒(IBDV)感染,通过RT-PCR进行病毒检测。 取病死鸡肿胀腔上囊用剪刀剪碎后进行充分研磨。 制成1∶10 组织悬液。离心取上清液按罗氏试剂盒说明书提取RNA。 提取RNA 作为模板,以5′ - TCACCGTCCTCAGCTTAC - 3′为上游引物,5′ - TCAGGATTTGGGATCAGC-3′为下游引物进行一步法RT - PCR 扩增IBDV 的VP2 基因片段。 将扩增产物送往派森诺生物工程有限公司测序,测序结果在GenBank 上进行Blast 比对。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果 普通培养基长出无色透明光滑菌落,S. S. 培养基形成红色菌落,大肠杆菌显色培养基形成蓝色菌落。 挑取单菌落接种血平板出现β 溶血现象。 革兰染色显示为两端钝圆的革兰阴性杆菌。 根据培养特性判定分离细菌疑似大肠杆菌。

2.2 PCR 方法鉴定大肠杆菌 大肠杆菌usp A 特异基因的PCR 扩增获得了与预期大小相符的860 bp扩增条带(图1)。 结合鉴别培养基的生长特性可确定待检细菌为大肠杆菌。

2.3 血清型鉴定 大肠杆菌单因子阳性血清凝集试验将大肠杆菌分离株血清型鉴定为O35。

2.4 药敏试验 纸片法药敏试验结果表明,质控菌株ATCC25922 的药敏结果完全符合要求。 大肠杆菌分离株的敏感药物有：硫酸庆大霉素、阿米卡星、阿莫西林、磷霉素钙、头孢曲松钠。

图1 大肠杆菌usp A 基因的PCR 扩增结果

3 病毒的分离鉴定

通过琼脂糖凝胶电泳观察,RT -PCR 结果获得了与预期大小相符的640 bp 的扩增条带(图2)。

图2 IBDV 的VP2 基因的RT-PCR 扩增结果

扩增产物测序结果在GenBank 上进行Blast 比对,结果表明,本试验毒株所测VP2 序列与IBDV 毒株同源性达97%上,所以确认本次鉴定毒株为IBDV。 将所测IBDV 的VP2 序列与该鸡场使用的IBDV 疫苗株B87 株、经典强毒株、超强毒株、变异株进行同源性比对。 由图3 结果可知,本试验鉴定毒株除与GenBank 提交的IBDV 分离株FJ719018. 1同源性达到97.4%,与本鸡场使用的疫苗株同源性为39.7%,说明本次IBDV 感染为野毒感染。

4 治疗

根据筛选的敏感药物,结合药物配伍原则,选择阿米卡星与阿莫西林进行联合用药。 同时对发病鸡舍全群皮下注射IBDV 高免卵黄抗体2 mL/只,该鸡场在用药与抗体后1 d,即控制了发病鸡群的死亡,连续用药与抗体3 d,基本控制了疫情,发病鸡群开始恢复正常。

图3 待测腔上囊样品与B87 疫苗株的VP2基因序列的同源性比较

5 讨论与分析

IBD 的发病特点是发病突然,死亡率高,所以一旦发生该病,造成的经济损失是巨大的。 在规模化肉鸡养殖中,预防IBD 的发生通常采用疫苗接种的方式,只不过不同养殖场选择的疫苗和免疫日龄不同,多数养殖场采用14 日龄左右进行活苗饮水免疫,目前也有一些养殖场选择在孵化场进行1 日龄注射免疫,所用疫苗主要是一些新型IBD 疫苗,如梅里亚的威立克(将IBDV 的VP2 基因插入HVT 构建的重组疫苗)[4]、法国诗华的囊胚宝和美国辉瑞的安囊宝(均属于抗原抗体复合物)等。 本试验中的发病鸡场采取的是14 日龄IBD 中等毒力活疫苗(B87 株)饮水免疫,但仍然在23 日龄出现2 栋鸡舍发病,究其原因很可能与潜伏感染、免疫不均匀或漏免有关。 从与IBDV 的其他经典毒株的同源性比对结果来看,本试验测序毒株为不同于经典强毒株、超强毒株、变异株的野毒,其生物学特性和基因特性有待进一步研究。

大肠杆菌血清型种类繁多,鸡源致病性大肠杆菌的传统血清型有O1、O2、O26、O78等,但不同地区分离的优势血清型不同[5]。 刘香敏等分离的大肠杆菌的主要血清型为O14、O35、O1、O2等[6];本试验分离的大肠杆菌血清型为O35,并非传统优势血清型,而是近年来常见流行血清型。

IBD 使用抗体进行紧急预防和治疗效果显著,所以发病鸡场在采用抗体和敏感药物后收到了立竿见影的效果。