Xpert MTB/RIF联合T-SPOT.TB对结核性胸膜炎及其耐药性的临床研究

孙海柏，张丽霞，刘佳庆，郭明日，李玉明，冯冉冉，刘雅，谢怡

（天津市海河医院，天津 300350）

结核性胸膜炎是由结核菌及其代谢物进入正处于高度过敏状态的机体胸膜腔引起的胸膜炎症，由于治疗不及时或不规范形成慢性包裹性积液、结核性脓胸及支气管漏等并发症，严重影响了患者的呼吸功能，甚至可导致死亡[1]。目前诊断方法中抗酸染色阳性率极低，仅为0%～25%，胸腔积液及胸膜活检标本培养阳性率低，且培养时间耗时过长，难以及时指导临床治疗，诊断金标准的胸膜活检阳性率不高。选择快速准确的诊断结核性胸膜炎的方法尤为重要。

1　资料与方法

1.1　一般资料

选取2012年6月-2016年10月于天津市海河医院就诊的结核性胸膜炎患者101例作为结核性胸膜炎组，其中男性75例，女性26例；年龄17～83，平均42.3岁。纳入标准：①患者有相应的临床表现，如发热、盗汗、疲乏、胸痛、刺激性干咳及结核中毒等症状；②超声提示有不同程度的胸腔积液，且胸部CT伴有或不伴有结核病灶；③胸腔积液为渗出液，其中淋巴细胞增多，所占比例50%；腺苷酸脱氨酶（adenylate deaminase，ADA）≥40 IU/L，抗结核抗体阳性；④胸腔积液涂片或培养结核杆菌阳性；⑤结核菌素纯蛋白衍生物皮试试验阳性或强阳性；⑥胸膜活检有典型结核病变（如结核性肉芽肿或干酪样病变）；⑦常规治疗无效，经抗结核治疗2～4周好转，最终确诊。选取同期院内其他疾病合并胸腔积液的患者79例作为对照组。其中，男性49例，女性30例；年龄21～78岁，平均43.5岁。患者有大叶性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、支气管肺癌、胸膜转移癌、恶性胸膜间皮瘤及恶性淋巴瘤等疾病，均无肺结核及肺外结核病史。纳入标准：①胸腔积液为渗出液，普通细菌培养阴性；②胸膜病理学检查排除结核；③无结核中毒症状；④临床上可明确胸水为原发性疾病所致。

1.2　方法

1.2.1标本采集两组在初诊时抽取胸水留取70 ml分装到4个5 ml无菌管和1个50 ml无菌容器内，第1管进行细菌学鉴定，第2管进行生化免疫实验，第3管用于利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF），第4管用于常规检测，50 ml无菌容器用于结核感染T细胞斑点检测（detection of T cell spot in tuberculosis，T-SPOT.TB）。

1.2.2实验方法①结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）检测。BACTEC MGIT960培养及耐药性，按照结核病诊断细菌学检验规程进行操作。②Xpert MTB/RIF检测。取1 ml胸水标本加入前处理管中，视样本性状加入2倍样本体积的标本处理液，涡旋振荡15～30 s静置15 min，吸取2 ml处理后样本缓慢加入反应盒，放入检测模块进行自动化检测。MTB结果判读根据DNA拷贝的高低分为高、中、低、极低及未检测出5个等级；利福平药敏结果分为：耐药、未检出及敏感。③T-SPOT.TB检测。采用淋巴细胞分层液经密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，计数并分别定量至2.5×106/ml。分离胸水单个核细胞（pleural effusion mononuclear ce11，PEMC），计数并分别定量至 2.5×106/ml、2.5×105/ml、2.5×104/ml及2.5×103/ml的细胞悬液（留取3例结核性胸膜炎及3例对照组所致胸腔积液进行小样本预试验，从而确定大样本实验的最佳PEMC浓度）。然后操作步骤完全按照说明书要求进行操作。

1.2.3仪器与试剂PLR-线性探针杂交酶显色法诊断试剂盒（德国Hain Lifescience公司），Hotstar Taq酶（德国Qiagen公司），MGIT960液体培养基及药敏管（美国BD公司），Hain GT Blot-48全自动杂交仪（德国Hain Lifescience公司），PCR仪（德国Hain Lifescience公司），Eppen-dorf 5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），生物安全柜（青岛海尔公司），结核感染T细胞检测试剂盒（上海复星公司），GeneXpert MTB/RIF检测系统（美国Cepheid公司）。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，计数资料以率表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　两组患者一般资料比较

两组患者葡萄糖、腺苷酸脱氨酶（adenylate deaminase，ADA）、抗结核抗体（anti tuberculosis antibody，TB-Ab）比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两组患者男女比例、年龄、唾液酸（sialic acid，SA）、血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、α-羟丁酸脱氢酶（alpha-hydroxybutyric dehydrogenase，HBDH）及白细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2　结核性胸膜炎组患者Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB检测结果分析

Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB诊断结核性胸膜炎的敏感性分别为82.18%（95%CI：0.78，0.85）和88.12%（95%CI：0.84，0.91），两组比较，差异有统计学意义（χ2=5.591，P=0.018），特异性分别为96.10%（95%CI：0.94，0.98）和 98.73%（95%CI：0.97，0.99），两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3　3种检测方法对断结核性胸膜炎的结果分析

以MGIT 960液体培养为标准，Xpert MTB/RIF的阳性率为79.57%，两种方法的Kappa值为0.277，一致性较低。以MGIT960检测为标准，T-SPOT.TB检测的阳性率为94.62%，两种方法的Kappa值为0.668，一致性较高。

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2.4　2种检测方法药敏检测结果分析

101例结核性胸膜炎的胸腔积液标本以药物敏感试验检测结果为金标准，采用Xpert MTB/RIF检测101例菌株的利福平耐药性。其中25例未检测出来，2例为阴性，76例标本分别采用BACTEC MU1T960及Xpert MTB/RIF进行检测，其中70例均耐药，4例均敏感，两种方法的kappa值为0.786，具有极好的一致性。

2.5　耐药基因突变位点分析及构成比

对利福平耐药阳性的6份标本进行基因突变位点分析。见表2。

表1　两组患者一般资料比较

表2　耐药基因突变位点分析及构成比

3　结论

T-SPOT.TB是近年来发展起来的一项快速诊断结核病的新技术，其原理是指当人体T细胞受到结核菌抗原的再次刺激后，活化的效应T细胞，产生抗结核感染免疫中的关键性细胞因子干扰素-γ[2]。此技术已经很成熟的应用于临床实验室检测，具有较高的敏感度和特异性，且与卡介苗不存在交叉反应的优势引起临床越来越多的重视[3]。对于患者全血的研究较多，但对于胸腔积液中干扰素的释放研究较少，本文收集患者的胸腔积液提取单个核细胞进行检测，以提高诊断的准确率，诊断结核性胸膜炎的灵敏性和特异性为96.10%和98.73%，均较高。LEE等[4]对欧洲及我国台湾地区的胸腔积液进行了小样本研究，结果发现胸水及外周血的T-SPOT.TB检测诊断结核性胸膜炎均有较好的敏感性、特异性，还有报道结核性胸膜炎有较高的阳性率达91.67%，报告结论与本文的实验结果相接近，并且在一些研究中也证实了T-SPOT.TB检测在肺外不同部位结核中的诊断价值[5]。有文献报道T-SPOT.TB检测联合ADA检测也可提高检测的准确率[6]。Xpert MTB/RIF是检测结核分枝杆菌及其对利福平耐药性的快速分子诊断方法，目前肺外结核运用较多，但是对胸腔积液的诊断中以金标准为标准其敏感性较低，当胸水中结核分枝杆菌太少或标本中含Taqman抑制物及分枝杆菌DNA提取效率低时，都有可能出现假阴性[7]。一些文献中报道结核性胸膜炎Xpert MTB/RIF敏感性和特异性分别为28.7%和96.6%，而相应的阳性和阴性预测值分别为96.1%和31.1%[8]。此外，近来应用Xpert MTB/RIF检测胸膜组织样本发现，Xpert MTB/RIF未能检测出任何已确诊的结核患者[9]。结合本文所做测试结果，Xpert MTB/RIF对胸腔积液灵敏度较低（15%～44%），准确度有限。胸腔积液Xpert MTB/RIF试验不能准确诊断胸膜结核，不推荐用作疑似胸膜结核患者的初始评价试验[10]。还有些报道认为Xpert MTB/RIF在非呼吸道标本中诊断结核病的敏感度不一致，但特异性均较高[11-12]。

Xpert MTB/RIF系统是用于检测结核病的分子诊断平台，由于大多数利福平耐药菌株都对异烟胁耐药，因此利福平耐药情况在一定程度上能作为耐多药结核病的检测指标[13]。其以通过rpoB基因RIF的耐药决定区的81 bp核心区为靶序列，能够在2 h内检测MTB和利福平的耐药性[14]。Xpert MTB/RIF检测利福平耐药性与MGIT960不一致的情况，可能是由于rpoB区内其他突变所致或者由于其他基因突变导致，理论上标本中含有≥1种的MTB混合培养或污染时，若其中一种有突变探针未涵盖的突变，将出现野生型带型[15]。本次实验对Xpert MTB/RIF与金标准对胸水的检测进行比较，结果一致性较好，但是标本量较少，有待于进一步研究，同时也值得临床进一步推广。

综上所述，T-SPOT.TB对结核性胸水诊断的敏感性及特异性，同时结合Xpert MTB/RIF的特异性能对结核性胸膜炎作出快速诊断和排除。Xpert MTB/RIF可直接检测MTB的核酸并可检出其对利福平的耐药性，使病人得到快速诊治。

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