TGF-β1对γδT细胞TLR-4受体及IL-2、IFN-γ水平的影响

杜发旺，刘红梅，何正光，杜先智，罗晓斌

（1.四川省遂宁市中心医院 呼吸内科，四川 遂宁 629000；2.重庆医科大学附属第二医院 呼吸内科，重庆 400010）

糖尿病患者血清转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）浓度高于健康人群[1-2]。TGF-β1能抑制免疫细胞的增殖与分化，介导炎症反应与机体免疫应答，但作用机制仍不明确[1-3]；γδT细胞除直接杀死病原菌外，还能分泌多种淋巴因子，在机体的细胞免疫、体液免疫中发挥重要作用[4-5]。为探讨TGF-β1对γδT细胞功能的影响，本研究采脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作用于γδT细胞，加入TGF-β1干预，检测γδT细胞分泌淋巴因子干扰素γ（Interferons-γ，IFN-γ）、白细胞介素2（Interleukin 2，IL-2）的变化，观察TGF-β1对γδT细胞Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR-4）表达的影响，从细胞信号通路的角度探讨TGF-β1抑制细胞炎症反应的可能机制。

1　材料与方法

1.1　材料

RPMI 1640干粉剂（美国Gibco公司），胎牛血清、LPS、TGF-β1、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自美国Sigma公司，RNA提取、cDNA制取、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）等相关试剂购自日本TaKaRa公司，PCR引物（大连宝生生物工程有限公司），Western blot检测相关试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），淋巴细胞分离（中国生命科学研究院），Anti-human γδTTCR–FITC、阴性空白对照试剂Mouse IgG1 K Isotype Control购自美国eBioscience公司，TLR-4抗体（美国Abcom公司）。

1.2　方法

1.2.1γδT细胞的获取取健康志愿者外周血100 ml，使用肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞[3]，将所得的外周血单个核细胞细胞用PBS调整细胞浓度至1×108个/ml，加入Antihuman γδT-TCR–FITC抗体标记的γδT细胞，恒温培养箱孵育30 min后离心，以Mouse IgG1 K Isotype Control为阴性空白对照，使用流式细胞仪分离、纯化γδT细胞。

1.2.2不同浓度的TGF-β1刺激γδT细胞将分离纯化的γδT细胞培养于6孔板中，每组设置3个复孔，重复3次。在6孔板中分别加入不同浓度的TGF-β1，使TGF-β1终浓度分别为0、5、10、20和50 mmol/L。在每孔中加入浓度为300 pg/ml的唑来膦酸，并将6孔板置于37℃、5%CO2恒温培养箱，换细胞培养液1次/2 d。第12天，采用ELISA法检测上清培养液中IFN-γ、IL-2的含量，并用Western blot和PCR检测TLR-4的蛋白表达及基因转录。

1.2.3LPS、TGF-β1刺激γδT细胞将分离纯化的γδT细胞培养于6孔板中，每组设置3个复孔，重复3次，分4组培养：①空白对照组；②LPS组（LPS 100 ng/ml）； ③ LPS+TGF-β1组（LPS 100 ng/ml+TGF-β120 mmol/L）； ④ TGF-β1组（TGF-β120 mmol/L）。并在每孔中加入浓度为300 pg/ml的唑来膦酸，并将6孔板置于37℃、5%CO2恒温培养箱，换细胞培养液1次/2 d。第12天，采用ELISA法检测上清培养液中IL-2、IFN-γ的含量，并用Western blot和PCR检测TLR-4的蛋白表达及基因转录。

1.2.4RT-PCRRT-PCR检测TLR-4的转录。将γδT细胞按1.2.2、1.2.3中的实验步骤培养12 d后，参照说明书步骤提取总RNA、制取cDNA、配制PCR反应液及Real time反应体系，设置好扩增条件，最后绘制出熔解曲线（每组实验重复3次）。TLR-4正向引物：5’-CCTGTCCCTGAACCCTATGA-3’，反向引物：5’-TCTAAACCAGCCAGACCTTGA-3’；内参 GAPDH正向引物：5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3’，反向引物 ：5’-CATGAGTCCTTCCACGATACC-3’。

1.2.5Western blot检测Western blot检测TLR-4蛋白的变化。将γδT细胞按照1.2.2、1.2.3中的实验步骤培养12 d后，参照说明书提取总蛋白、检测蛋白浓度，并调整好浓度（4μg/μl），在沸水中加热5 min。进行SDS-PAGE电泳（加入蛋白样品15μl/孔），用5%脱脂奶粉封闭1 h，再加入按照稀释一抗（1∶1 200）或内参（1∶3 000），4℃恒温冰箱封闭12 h，次日再次洗膜3次，加入5%脱稀释加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h，再次洗涤后显影成像，并用Quantity One软件分析各条带灰度值，每组实验重复3次。

1.2.6ELISA法收集TGF-β1、LPS处理的各实验组上清液，按照ELISA双抗体夹心法试剂盒说明书测定上清液中IL-2、IFN-γ的浓度。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，方差分析的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　γδT细胞的纯度

从外周血PBMC中用流式细胞仪分离出的γδT细胞，其纯度可达92.54%，该纯度可以满足γδT细胞的功能研究。图1A为同型阴性对照，图1B为γδT细胞在外周血中占的比例（6.25%）。见图1。

2.2　γδT细胞TLR-4 mRNA的表达

不同浓度TGF-β1组TLR-4 mRNA的转录水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=6.826，P=0.018），TGF-β1对 γδT细 胞 的TLR-4基 因转录有抑制作用，且随TGF-β1浓度增加，TLR-4 mRNA的表达呈梯度下降；20和50 mmol/L TGF-β1组与0 mmol/L TGF-β1组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

分组培养后，各实验组TLR-4基因转录水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=8.191，P=0.035），进一步两两比较经LSD-t检验，LPS组TLR-4基因转录水平与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；LPS+TGF-β1组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但较LPS组TLR-4基因转录水平下降（P＜0.05）。见图3。

2.3　γδT细胞TLR-4蛋白的表达

不同浓度TGF-β1组 TLR-4蛋白的表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=5.312，P=0.023），TGF-β1对γδT细胞TLR-4蛋白的表达有抑制作用，且随TGF-β1浓度增加，TLR-4蛋白的表达水平呈梯度下降；进一步两两比较经LSD-t检验，20和50 mmol/L TGF-β1组与0 mmol/L TGF-β1组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

分组培养后，各实验组TLR-4蛋白的表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=6.215，P=0.016），进一步两两比较经LSD-t检验，LPS组TLR-4蛋白表达较空白对照组升高（t=4.893，P=0.008），TGF-β1组TLR-4蛋白表达较空白对照组降低（P＜0.05），LPS+TGF-β1组 TLR-4蛋白表达较空白对照组升高（P＜0.05），但较LPS组TLR-4蛋白表达水平下降（P＜0.05）。见图5。

2.4　IFN-γ水平比较

不同浓度TGF-β1组的IFN-γ水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=11.298，P=0.033），TGF-β1抑制IFN-γ的表达，且随TGF-β1浓度增加，IFN-γ水平越低；进一步两两比较经LSD-t检验，20和50 mmol/L TGF-β1组与0 mmol/L TGF-β1组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

分组培养后，各实验组的IFN-γ水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=11.319，P=0.039），进一步两两比较经LSD-t检验，LPS组的IFN-γ表达较空白对照组增加（P＜0.05），TGF-β1组的IFN-γ表达较空白对照组降低（P＜0.05），LPS+TGF-β1组的IFN-γ表达较空白对照组增加（P＜0.05），但较LPS组的IFN-γ表达水平下降（P＜0.05）。见图7。

图1　γδT细胞的纯度

图2　不同浓度TGF-β1对γδT细胞TLR-4 mRNA表达的影响　（±s）

图3　各实验组TLR-4基因转录水平比较　（±s）

图4　不同浓度TGF-β1对γδT细胞TLR-4蛋白表达的影响

图5　各实验组TLR-4蛋白的表达

图6　不同浓度TGF-β1对IFN-γ水平的影响　（±s）

2.5　IL-2水平比较

不同浓度TGF-β1组的IL-2水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=8.817，P=0.025），TGF-β1抑制IL-2的表达，且随TGF-β1浓度增加，IL-2水平越低；进一步两两比较经LSD-t检验，20和50 mmol/L TGF-β1组与0 mmol/L TGF-β1组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图8。

分组培养后，各实验组的IL-2水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=7.948，P=0.012），进一步两两比较经LSD-t检验，LPS组IL-2的表达较空白对照组增加（P＜0.05），TGF-β1组的IL-2表达较空白对照组降低（P＜0.05），LPS+TGF-β1组的IL-2表达较空白对照组增加（P＜0.05），但较LPS组的IFN-γ表达水平下降（P＜0.05）。见图9。

图7　各实验组IFN-γ水平比较　（±s）

图8　不同浓度TGF-β1对IL-2水平的影响　（±s）

图9　各实验组IL-2水平比较　（±s）

3　讨论

γδT细胞属于CD4-、CD8-双阴性细胞，抗原的提呈及激活不受MHC限制，作用介于固有免疫与适应性免疫之间，识别抗原后，通过一系列的信号转导机制，活化及促进炎症因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-17等的分泌[4-6]，直接或间接参与机体细胞免疫及体液免疫，在抗感染早期及启动机体免疫应答过程中发挥重要作用。

IFN-γ、IL-2是炎症反应及免疫反应过程中的重要因子，IFN-γ具有很强的免疫调节作用，能够激活及增强机体免疫细胞，并介导相关抗炎机制，增强对病原微生物及感染细胞的杀伤作用[5-6]，国内外大量研究显示，γδT细胞是机体早期产生IFN-γ最主要的细胞，同时也能分泌较多的IL-2，IL-2具有多种生物功能，最引人关注的是能激活T细胞，并维持T细胞的活化及增殖，调节机体免疫应答，促进抗体产生，参与炎症反应及杀灭病原微生物[7]，本研究ELISA结果显示，加入LPS后，IFN-γ、IL-2水平升高，得出相似的结论。

TGF-β1属于多功能的生长调节因子，能调节免疫细胞的增殖与分化、介导炎症反应与机体免疫应答，改变机体的免疫能力[8-9]，近年来研究表明，TGF-β1能抑制TLR-4受体信号传导途径及诱导免疫细胞凋亡[10-11]，但是其具体的作用机制仍需进一步探讨。Toll样受体是一类天然免疫受体，能识别某些病原体或者其产物的分子结构，然后启动炎症信号通路，促进炎症介质的释放，激活免疫系统。TLR-4主要识别革兰阴性菌LPS，激活免疫系统相关跨膜通道，释放大量的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-17等炎症因子[12-13]。本研究使用LPS刺激γδT细胞后，TLR-4的转录及表达增强，且γδT细胞产生IFN-γ、IL-2的能力提高。加入TGF-β1后，IFN-γ、IL-2水平较LPS组下降，同时TLR-4在基因转录及蛋白表达水平下降，这提示TGF-β1能够下调LPS对γδT细胞的刺激作用。同时观察到，γδT细胞总数下降，并且γδT细胞的增殖向Vδ1γδT细胞偏倚，提示TGF-β1可能通过某种机制抑制γδT细胞的增殖及改变γδT细胞的亚群，对γδT细胞起负性调节作用，同时也在一定程度上解释了糖尿病患者免疫低下、易感的机制，可能与免疫细胞增殖抑制、细胞亚群改变、抗炎因子减少等有关。本实验还发现，尽管LPS+TGF-β1组γδT细胞分泌产生的IFN-γ、IL-2及TLR-4转录、表达水平较LPS组下降，但是仍较空白对照组增加，提示LPS对γδT细胞的刺激作用除与TLR-4途径密切相关外，还可能通过其他途径对γδT细胞起刺激促进作用，需进一步研究。

本实验研究发现，TGF-β1能减弱γδT细胞分泌IFN-γ、IL-2等淋巴因子，并减少γδT细胞TLR-4蛋白的转录及表达，下调LPS对γδT细胞的刺激促进作用，并改变γδT细胞的增殖及分化，这从一定程度解释了炎症反应、细胞免疫与细胞信号通路的关系，有助于对病原微生物的免疫逃避、机体免疫调控的理解，也从一方面解释了糖尿病患者易感染的可能机制，但其具体的抑制分子机制仍不明确，需进一步研究。

参 考 文 献：

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