凤冈富锌硒茶对ERp57蛋白酶的抑制作用及其有效成分的虚拟筛选*

张莹，李惠琼，邹佳，王滔，李玲玲，申慧芳，岳续朋，崔国祯

（1.遵义医学院 珠海校区生物工程系（广东省珠海市中药基础及应用研究重点实验室），广东 珠海 519041；2.广州中医药大学第二附属医院，广东 珠海 519015）

心血管疾病严重威胁人类健康，其死亡率居我国各种疾病之首[1]。有研究表明，饮用绿茶可以显著降低心血管疾病的死亡率[2]，但具体作用机制尚不清楚。本实验以蛋白酶ERp57为抗血小板聚集药物的作用靶点，采用虚拟筛选与实验验证相结合的方法，对凤冈富锌硒茶预防心血管疾病的作用靶点和有效成分进行探讨，进一步认识绿茶抗心血管疾病的作用机制。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

凤冈富锌硒茶由贵州省凤冈县万壶缘锌硒茶业有限公司提供，乙腈、甲酸、甲醇（色谱纯）购自德国Merck公司，分析标准品表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）（纯度≥98%）、氯吡格雷购自上海阿拉丁试剂公司，分析标准品表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和咖啡因（Caffeine，CAF）（纯度≥98%）购自宝鸡金泰区辰光生物公司，胰岛素溶液（美国Sigma公司），ERp57蛋白酶（本实验室自制），新西兰兔[广东省医学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（粤）2014-0035]，枸橼酸钠采血管（冀州市博昌医疗器械有限公司），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）（美国 Sigma公司）。

1.2　仪器与设备

超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）[美 国 Waters公 司， 配 有Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7μm）色谱柱、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站]，冷冻干燥机（ALPHA2-4/LSC PLUS型）（德国CHIRST公司），Multiskan Mk3酶标仪（美国宝特公司），旋转蒸发仪（德国IKA公司），血小板聚集仪（美国Helena公司），台式低速离心机（长沙赫西仪器装备有限公司）。

1.3　方法

1.3.1凤冈富锌硒茶的提取取凤冈富锌硒茶置于80℃烘箱烘干，打粉机粉碎后取200 g茶粉，加入2 L沸腾的双蒸水中，煎煮10 min，纱布过滤并收集滤液。滤渣再加入2 L沸腾的双蒸水中，重复上述步骤2次。3次滤液合并，用旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥仪干燥后称重，得到绿茶水提取物。

1.3.2UPLC检测绿茶水提取物①供试品溶液的制备。精确称取绿茶水提取物0.2 g，加入10 ml 50%甲醇溶液于试管中，超声5 min，用注射器吸取2 ml，0.22μm滤膜过滤，得到待测液。②标准品溶液的配制。精确称取标准品EGCG、EGC、ECG和CAF各2 mg，加入5 ml 50%甲醇溶液于试管中，超声5 min，用0.22μm滤膜过滤，得到标准品溶液。③UPLC色谱条件。UPLC仪，流动相A：45 ml乙腈、10 ml甲酸，以去离子水定容至500 ml；流动相B：400 ml乙腈、10 ml甲酸，以去离子水定容至500 ml。色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50.0 mm，1.7μm）。梯度洗脱条件：0～ 10 min（100% A），10～32 min（100%～80% A）。流量1.0 ml/min，柱温35℃，检测波长278 nm；进样量10μl。

1.3.3ERp57蛋白酶活性测定采用胰岛素浑浊度分析方法检测绿茶水提取物及其化合物对ERp57蛋白酶活性的抑制作用[3-4]。将反应体物[胰岛素、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、ERp57蛋白酶和待测样品]加入到96孔板中反应振荡30 s，检测630 nm波长处的吸光度，读数1次/4 min，持续检测68 min，实验重复3次。酶抑制率（%）=[1-（OD化合物+ERp57+DTTODDTT）/（ODERp57+DTT-ODDTT）]×100%[5]。

1.3.4血小板聚集实验①获取富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）。用枸橼酸钠抗凝采血管从兔耳缘动脉采血。将血液750 r/min离心15 min，收集上清得PRP；剩余血样2 800 r/min离心10 min，收集上清得PPP。②血小板聚集率的检测。用PPP调零，以PRP为血小板供体，检测不同浓度绿茶水提取物对血小板聚集的干预作用，设置模型组（ADP处理）、阳性对照组（氯吡格雷处理），以及30、100和300μg/ml绿茶水提取物干预组。PRP与待测药物作用5 min后，加入15μmol/L ADP溶液，用血小板聚集仪检测血小板聚集情况。

1.3.5计算机虚拟筛选①三维结构的获得与处理。从Protein Data Bank下载ERp57的晶体结构（PDB ID：3F8U），按照MOE软件的说明书对蛋白结构进行虚拟筛选前的结构准备。②绿茶中小分子数据库的构建。根据中药系统药理学数据库[6]，收集绿茶中的20种小分子，用MOE软件建立绿茶小分子数据库，并做能量最低化操作。③虚拟筛选。运行分子模拟软件MOE，以蛋白ERp57的CGHC残基为活性位点。从绿茶小分子库中虚拟筛选ERp57的抑制剂。

1.4　统计学方法

数据分析采用Graphpad prism 6.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　绿茶水提取物的成份

取200 g茶粉经提取后，得到62.12 g绿茶水提取物，得率为31.06%。利用UPLC对绿茶水提取物中的成分进行分析。绿茶水提取物UPLC色谱图中各目标峰的分离度和峰形较好，绿茶水提取物中的各种成分与4种标准品在相同的保留时间处均有相对应的峰出现，检出各成分与标准品的保留时间一致，说明绿茶水提取物中主要含有EGC、ECG、EGCG、CAF 4种化合物。见图1。

图1　278 nm波长处绿茶水提取物的成分分析

2.2　不同浓度绿茶水提取物对ERp57酶活性的影响

与模型组相比，ERp57蛋白酶活性随着绿茶水提取物浓度的增加而降低，表明绿茶水提取物对ERp57的活性有抑制作用，半数抑制率为30～100μg/ml。见图2。

2.3　绿茶水提取物对血小板聚集的影响

各组血小板聚集率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=16.574，P=0.000），不同处理组对血小板聚集率的影响不全相同，100和300μg/ml绿茶水提取物干预组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明绿茶水提取物对血小板聚集有抑制作用。绿茶水提取物抑制ADP诱导的血小板聚集，且呈剂量依赖关系。见图3。

2.4　计算机虚拟筛选结果

绿茶小分子库经虚拟筛选过后，以活性位点和化合物的亲和力为指标，结合能力越小，得分越高，配体和受体的亲和力更大，从20个化合物中获得3个打分较高，并符合实验验证要求的小分子。蛋白质ERp57以丝带模式渲染，EGCG、ECG、EGC结合能分别为 -21.8、-19.1 和 -15.7 kcal/mol（1kcal=4.184kJ）（见图4）。筛选后3种小分子的化学结构见图5。

2.5　绿茶水提取物和化合物单体对ERp57活性的抑制作用

各组ERp57抑制率比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=18.848，P=0.000），绿茶水提取物及化合物对酶活性抑制率的影响作用不同。其中，检测的3种化合物中，EGCG对ERp57活性的抑制作用最强。绿茶水提取物、EGC、EGCG及ECG对ERp57活性均有一定的抑制作用，并呈剂量依赖关系。见图6。

图2　绿茶水提取物对ERp57酶活性的抑制作用

图3　绿茶水提取物对血小板聚集的影响

图4　筛选后的3个ERp57蛋白酶抑制剂

图5　筛选后的3个ERp57抑制剂化学结构

图6　绿茶水提取物及化合物对ERp57的抑制率比较

3　讨论

经过长约11年的流行病学调查发现，长期饮用绿茶能够显著降低心血管疾病患者的死亡率[2]，提示绿茶具有预防心血管疾病的作用。本实验通过提取凤冈富锌硒茶，基于ERp57蛋白酶为抗血小板聚集的作用靶点，采用计算机虚拟筛选与实验验证相结合的方法，进一步证明，绿茶水提取物有较强的抑制ERp57蛋白酶活性的作用，且通过体外血小板聚集实验，绿茶水提取物显著抑制ADP诱导的血小板聚集。其中，EGCG是抑制ERp57蛋白酶的主要活性成分。该研究为进一步认识绿茶抗心血管疾病的保健功能，为绿茶产业的发展和应用提供科学依据。

蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族是一类在细胞内质网内调节肽链氧化折叠等多重功能的巯基-二硫键氧化还原酶，是一种潜在的治疗血栓的药物靶点[7]。ERp57是PDI家族的成员之一。最近研究发现，ERp57蛋白酶在血小板聚集和血栓的形成中也发挥重要作用[8]，ERp57基因敲除小鼠在血小板数量及表面糖蛋白的表达上都未发生变化，但其尾静脉出血时间延长，血小板聚集率下降，在添加外源性的ERp57蛋白酶后，血小板聚集缺陷得到很好地改善[9]，提示抑制ERp57蛋白酶活性，可以显著抑制血小板的聚集。筛选出具有拮抗ERp57蛋白酶活性的物质，对开发抗血栓类药物或保健品方面都有巨大的应用潜力。

本实验采用胰岛素浑浊度分析法测定绿茶水提取物对ERp57蛋白酶的抑制作用。与模型组对比，随着绿茶水提取物浓度的不断提高，ERp57蛋白酶的活性逐渐降低，绿茶水提取物对ERp57蛋白酶有明显的抑制作用；且血小板聚集实验表明，与模型组相比，绿茶水提取物显著抑制ADP诱导的血小板聚集。进一步通过虚拟筛选结合实验验证的方法，发现ECG、EGC和EGCG 3种化合物对ERp57蛋白酶活性均有明显的抑制作用，并呈一定剂量依赖关系。其中，EGCG对ERp57蛋白酶活性的抑制作用最强。

实验结果显示，3种化合物对ERp57蛋白酶活性的抑制作用强度分别为EGCG＞EGC＞ECG。3种化合物的结构相似，基本结构均为α-连或邻苯酚基苯并吡喃，3者结构中A环的5-位和7-位均带有1个酚羟基，其结构差异主要体现在C环的2-位和3-位上所带的基团类型，主要表现为2-位上带邻苯酚基或者是连苯三酚基，3-位带羟基或者是没食子酯结构。其中，EGC与ECG相比较，EGC中C环的2-位带有连苯三酚基，而ECG中为邻苯酚基，EGC比ECG多1个羟基；EGCG与EGC比较，差异主要表现在C环的3-位上，EGCG中3-位带有没食子酯结构，没食子酯结构中带有3个羟基，而EGC中的3-位带有1个羟基，EGCG带有的羟基数量大于EGC；EGCG与ECG的结构差异表现在C环的2-位上，EGCG带有1个连苯三酚基，ECG带邻苯酚基，EGCG比ECG多1个羟基；3者结构相似，但对ERp57蛋白酶活性的抑制作用存在差异，由3者化学结构分析可以说明羟基对于化合物的活性而言占有主导地位，羟基具有极强的抗氧化活性，羟基数目越多，可提供的氢原子越多，其抗氧化活性越强。由此可以推测，3种化合物对ERp57蛋白酶抑制作用的强弱源于羟基所处位置及数量。

儿茶素类化合物是含有黄烷-3-醇结构的一大类化合物，该类化合物具有多个酚羟基而显示出强抗氧化活性。儿茶素与蛋白质通过疏水键相结合，通过氢键和环氧基团进一步稳定，儿茶素高亲和力的氧化结构域可使蛋白质构象发生变化，其中氧化和二聚体的形成伴随着蛋白构象的改变和表面疏水蛋白质的增加[10]。儿茶素在发挥作用时，优先结合到氧化酶活性位点附近，这可能是影响ERp57蛋白酶氧化还原功能及其他配体相互作用的主要原因，从而使ERp57活性受到抑制。研究人员发现，给小鼠注入ERp57蛋白酶拮抗剂，发现其尾部出血时间延长，血小板聚集作用欠佳，αⅡbβ和P选择素的表达受到抑制[11]。儿茶素对ERp57蛋白酶活性抑制作用机制，以及与αⅡbβ受体和P选择素的相关性，有待进一步实验验证。

综上所述，凤冈富锌硒茶提取物对ERp57蛋白酶具有一定的抑制作用，其中EGCG是主要的活性成分。本实验为进一步研究绿茶预防心血管疾病的机制提供了科学依据。其次，基于计算机虚拟筛选与实验验证相结合的方法为探讨中药的作用靶点和有效成分研究提供了重要研究思路。

参 考 文 献：

[1]陈伟伟, 高润霖, 刘力生, 等. 《中国心血管病报告2015》概要[J].中国循环杂志, 2016, 31(6): 521-529.

[2]LIU J, LIU S, ZHOU H, et al. Association of green tea consumption with mortality from all-cause, cardiovascular disease and cancer in a Chinese cohort of 165,000 adult men[J]. Eur J Epidemiol, 2016,31(9): 853-865.

[3]CUI G, SHAN L, CHU I K, et al. Identification of disulfide isomerase ERp57 as a target for small molecule cardioprotective agents[J]. RSC Adv, 2015, 5(91): 74605-74610.

[4]CUI G, SHAN L, GUO L, et al. Novel anti-thrombotic agent for modulation of protein disulfide isomerase family member ERp57 for prophylactic therapy[J]. Scientific Reports, 2015, DOI:10.1038/srep10353.

[5]JASUJA R, PASSAM F H. Protein disulfide isomerase inhibitors constitute a new class of antithrombotic agents[J]. Journal of Clinical Investigation, 2012, 122(6): 2104-2113.

[6]RU J, LI P, WANG J, et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].Journal of Cheminformatics, 2014, 6(1): 1498-1504.

[7]FLAUMENHAFT R, FURIE B, ZWICKER J I. Therapeutic implications of protein disulfide isomerase inhibition in thrombotic disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35(1): 16-23.

[8]SCHULMAN S, BENDAPUDI P, SHARDA A, et al. Extracellular thiol isomerases and their role in thrombus formation[J]. Antioxid Redox Signal, 2016, 24(1): 1-15.

[9]WANG L, WU Y, ZHOU J, et al. Platelet-derived ERp57 mediates platelet incorporation into a growing thrombus by regulation of the αIIbβ3 integrin[J]. Blood, 2013, 122(22): 3642-3650.

[10]TRNKOVÁ L, RICCI D, GRILLO C, et al. Green tea catechins can bind and modify ERp57/PDIA3 activity[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2013, 1830(3): 2671-2682.

[11]WU Y, AHMAD S S, ZHOU J, et al. The disulfide isomerase ERp57 mediates platelet aggregation, hemostasis, and thrombosis[J]. Blood, 2012, 119(7): 1737-1746.