连作花生土壤理化性质的变化特征及其与土壤微生物相关性分析

石程仁，禹山林，杜秉海，杨 珍，陈 娜，潘丽娟，王 通，王 冕，迟晓元 ，陈明娜,*

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2. 山东农业大学，山东 泰安 271000)

花生是我国重要的油料和经济作物，多种植于丘陵、旱薄地，据统计2016年我国花生种植面积472.67万公顷，占油料作物宗面积的33.43%[1-2]。由于我国花生产区相对集中，加上种植效益和环境条件等各方面因素的影响，花生连作现象普遍，山东、河南等主产区常多年连片、大规模种植，有的甚至连作了10～20年[1]。连作使花生病虫害加剧，品质下降，连作 2～3 年，荚果平均减产19.8%～33.4%[3-4]。连作障碍已成为当前我国花生生产面临的突出问题之一。研究发现，造成连作障碍的因素主要包括土壤营养元素失衡，作物根系分泌物、腐解物等化感物质的自毒作用，土壤微生物区系失衡，土壤酶活性改变等方面，归结起来就是根际微生态系统发生改变[5]。

作物对营养物的吸收具有偏好性，同样花生对土壤中营养元素也有特定的需求种类和吸收比例，长期单一种植必然会使土壤中营养元素失衡[5]。封海胜等[6]曾报道，中等肥力砂壤土花生连作三年后，土壤中速效磷、速效钾和速效硼的含量较轮作土壤中分别减少了52.9%、40.6%和53.8%，水解氮含量变化不大。花生长期连作使得从土壤中吸收的氮素较少，氮肥利用率和产投比降低；而对磷、钾、硼、铁、钙等元素的吸收量较多[7-8]，导致土壤中营养元素失衡，花生的生长发育就会受到影响，抗逆能力降低，从而使其产量和品质下降。

根际微生态系统是一个以植物为主体，以植物—土壤—微生物及其环境条件相互作用过程为主要内容的有机系统[3]。植物、土壤、微生物的相互关系维系着根际微生态系统的生态功能。微生物是根际微生态系统的关键因子，在土壤物质循环中起重要作用，植物—土壤之间的相互作用一般会通过土壤微生物进行调节[9]。微生物的生长代谢不仅与花生的生长、发育密切相关，而且能敏锐反映土壤微环境的变化[10-11]。因此，本研究通过分析花生连作过程中根系土壤营养元素的变化特征及其与花生根系微生物群落结构的相关性，可以有效阐明花生连作过程中根际土壤微生态系统的变化情况，对了解连作花生土壤微生态系统各因子之间的相互关系具有十分重要的意义，为进一步探究花生连作障碍的关键因子以及达到从根本上缓解花生连作障碍的目标打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用盆栽试验，供试花生品种分别为鲁花12号和花育25号，土壤采自青岛市近十年未种植过花生的耕层土，过1 cm筛后混匀，选用高26 cm，内径36 cm的盆进行试验，每盆装土18 kg。每盆栽植2株，每个品种栽植20盆，连续种植三年。盆栽试验采用旱棚模式：整个种植过程中不施加任何肥料；浇水则完全用灭菌水浇灌；取样深度为表层以下5～10 cm处。花生每年5月上旬种植，生育期130 d。每年收获期，每个花生品种随机选择10盆，用直径1.5 cm土钻于表层以下5～10 cm根部处取土样混匀，具体取样方法参见Mingna Chen等[12]，采集的土壤样品于-80 ℃冰箱备用。

1.2 土壤元素的测定与分析

两个花生品种连作一年、两年、三年的土壤样品分别命名为L12-1、H25-1、L12-2、H25-2、L12-3和H25-3，例如L12-1为鲁花12连作一年的土壤，H25-1为花育25号连作一年的土壤。土壤样品剔除其中的花生根系及残体等杂物，经自然风干，研磨过筛备用。土壤pH值用水浸提电位法测定(水土比5:1)，pH计为HI2221型，有机质用重铬酸钾容量法测定，水解氮用碱解扩散法测定，速效磷用NaHCO3浸提—钼蓝比色法测定，速效钾用乙酸铵浸提火焰光度法测定，全盐量采用残渣质量烘干法测定，有效硼、有效铁、有效锰、有效铜、有效锌、有效钼采用ICP-OES电感耦合等离子体发射光谱仪法测定[13-14]。

1.3 土壤微生物的群落结构分析

采用16S rRNA和18S rRNA基因文库构建的方法对土壤中的细菌和真菌微生物群落结构进行分析[12,15]。针对两个不同花生品种连作一年、两年、三年收获期的根系土壤分别构建了6个16S rRNA基因文库(命名为L12-B1、H25-B1、L12-B2、H25-B2、L12-B3和H25-B3)和6个18S rRNA基因文库(命名为L12-E1、H25-E1、L12-E2、H25-E2、L12-E3和H25-E3)。例如：L12-B1为鲁花12号连作一年土壤的细菌文库，L12-E1为鲁花12号连作1年的真菌文库。文库构建后对所有测序序列的处理如Mingna Chen 等所述[13,15-16]。采用SPSS 18.0和Genesis program 1.7软件对16S rRNA基因文库和18S rRNA基因文库的分类单元分别进行聚类分析和热图(heatmap)分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对连作三年花生根系土壤的pH值及营养元素数据进行聚类分析及方差分析。用双因素方差分析(two-way ANOVA)检验不同连作年限和不同花生品种根系土壤理化性质的差异。使用R语言的Vegan软件包分析不同连作年限花生根系土壤微生物群落结构的相似性和差异性及其与土壤理化因子之间的相互关系。

2 结果与分析

2.1 连作花生土壤理化性质的变化特征分析

聚类分析表明，6个花生连作土壤样品的理化性质可以分为三簇，连作一年、两年、三年的土壤样品分别被归为一类，其中连作两年和连作三年的土壤理化性质分类更为接近 (图1)。

进一步对不同连作年限花生根系土壤的pH和土壤元素含量进行分析，结果表明，连作确实对土壤理化性质影响显著，但土壤pH及不同元素对连作的响应存在差异(图2)；部分土壤理化性质也受花生品种的影响(表1)。土壤pH和有效磷、全盐、有效钾、有效锰、有效铁、有效铜含量受连作年限影响显著，连作两年后指标变化尤其显著。鲁花12和花育25连作1年、2年、3年土壤pH分别是7.20、7.60、7.49 和7.21、7.62和7.54，连作两年比连作一年的pH有较大幅度提高，第三年的pH值又略有降低，两个品种表现一致。土壤中有效磷和全盐含量则随着连作年限的增加显著降低，连作两年的降低幅度尤为显著。两个品种三年连作土壤的有效磷含量分别为79.1、49.17、45.90和75.57、55.93、47.27(mg/kg)；全盐量分别为1.55、0.75、0.23和1.24、0.45、0.24(g/kg)。花生连作一年根系土壤有效钾、有效锰、有效铁、有效铜的含量与连作两年、三年土壤中的含量差异显著，而连作两年和连作三年土壤中的含量则差异不大(图2)。另外，两个品种根系土壤的水解氮、有效磷、有效硼含量和全盐量差异显著，其他土壤理化指标品种间没有显著差异 (表1)。

图1 花生连作土壤理化性质聚类分析 Fig.1 Clustering analysis of physical and chemical properties of peanut continuous cropping soil

测定项目Items for testing平方和 Sum of squares均 方 Mean squareF 值F value p值 p value pH 0.0020 0.0020 0.1300 0.7249 有机质Organic matter0.0021 0.0021 0.00000.9848水解氮 Hydrolyzable nitrogen 12.4991 12.4991 12.8260 0.0038∗∗有效磷 Available phosphorus11.0450 11.0450 10.4140 0.0073∗∗有效钾 Available potassium15.4933 15.4933 0.35500.6117全盐量 Total salt content0.1740 0.1740 114.3370 0.0001∗∗有效锰 Available manganese0.1605 0.1605 0.49000.4974有效钼 Available molybdenum0.0042 0.0042 2.83500.1180有效硼 Available boron0.0168 0.0168 21.45400.0006∗∗有效铁 Available iron0.0090 0.0090 0.00700.9394 有效铜 Available copper0.0038 0.0038 1.49200.2453 有效锌 Available zinc0.0004 0.0004 0.10800.7485

注：**p<0.01。

图2 不同连作年限花生根系土壤pH值及营养元素含量 Fig.2 The pH value and element concentrations of peanut root soil under different continuous cropping period 注：图中不同大写字母表示不同连作年限土壤pH值和元素含量显著差异程度(p<0.01)；图中数据为平均值± 标准误差(n=3)。 Note: The different capital letters in the figure indicate the significant difference between soil pH and element content in different continuous cropping years (p<0.01); the data in the figure are mean ± standard error (n=3).

图3 16S rRNA基因文库OTUs的聚类分析 Fig.3 Clustering analysis of OTUs detected from 16S rRNA gene libraries

2.2 连作花生土壤微生物的群落结构及与土壤环境因子的相关性分析

对6个土壤样品16S rRNA基因文库和6个样本的18S rRNA基因文库的分类单元分别进行了聚类分析和热图分析。结果表明，花生连作对根系土壤微生物群落结构存在显著影响，6个细菌文库和6个真菌文库的聚类结果一致，连作一年、两年、三年的土壤微生物文库分别被聚为一类，连作两年与连作三年的土壤文库聚类距离更为接近。表明花生根系土壤微生物群落结构确实受连作影响，而且对不同连作年限的响应存在差异，受花生品种影响较小。对比连作花生根系土壤细菌、真菌群落的聚类分析和土壤理化指标的聚类分析结果，发现聚类规律一致，即无论是不同花生品种微生物群落的聚类还是土壤理化指标的聚类，都是连作相同年限的土壤各聚为一类，且连作两年与连作三年的土壤聚类距离更接近(图1、图3、图4)。

图4 18S rRNA基因文库真菌类群的热图分析 Fig.4 Heatmap analysis of the fungal orders or phylotypes detected in the 18S rRNA gene libraries

图5 土壤微生物群落与土壤元素的关联分析 Fig.5 Correlation analyses on soil microbial communities and soil elements 注：Y1，Y2，Y3分别代表连作1年、2年、3年，A为土壤元素与16S rRNA基因文库的联合分析，B为土壤元素与18S rRNA基因文库的联合分析。Note: Y1, Y2, and Y3 represent continuous cropping for 1 year, 2 years, and 3 years, respectively. A is a collection analysis of soil elements and 16S rRNA gene library sequences, and B is a collection analysis of soil elements and 18S rRNA gene library sequences.

另外，选取受连作影响显著的全盐和四种土壤营养元素(有效磷、有效钾、有效锰和有效铜)与连作过程中的土壤细菌群落和真菌群落分别进行典型相关分析(Canonical Correlation Analyses，CCA)结果表明，连作一年、两年、三年的根系土壤微生物群落分别被归为一类，全盐量和有效铜的含量与连作两年、三年土壤的微生物群落结构相关性强，而有效钾、有效磷、有效锰的含量与连作一年的土壤微生物群落结构相关性强(图5)。

3 讨论与结论

花生根系土壤的理化性质受连作年限影响。黄玉茜[7]发现土壤中全氮含量、碱解氮含量随着花生连作年限的增加总体呈先增后降再增的趋势，而全磷、有效钾含量则伴随连作呈下降趋势，有效 Fe、Cu、Zn的含量均随连作呈逐年下降的趋势。封海胜等[6]对中等肥力砂壤土连作花生的研究表明，土壤中速效磷、速效钾和速效硼的含量随连作年限的增加而减少，土壤中三者的含量在连作三年的土壤中较轮作土壤中分别减少了52.9%、40.6%和53.8%，而水解氮含量变化不大。本文对两个不同花生品种连作一年、两年、三年的土壤pH值以及11个常量、微量营养元素含量进行分析，聚类分析结果表明连作一年、两年、三年的土壤样品分别被归为一类，其中连作两年和连作三年的土壤理化性质更为接近。三年连作过程中，pH值先有较大幅度升高而后略有降低，全盐量以及有效磷、有效钾、有效锰、有效铁、有效铜的含量受连作影响显著，其中全盐量和有效磷含量随连作年限增加而逐年降低，连作两年土壤中的有效钾、有效锰、有效铁、有效铜的含量比连作一年的土壤显著降低，而与连作三年土壤中的含量差异不大。另外，根系土壤的水解氮、有效磷、有效硼含量和全盐量还受品种影响显著。

综上所述，连作确实造成花生根系土壤营养元素失衡，长期连作和短期连作对花生根系土壤pH值及元素含量的影响效力不同，并且不同理化指标对连作年限以及品种的响应也有所差异。

对两个花生品种连作一年、两年、三年的根系土壤微生物群落结构的分析结果表明，连作对土壤微生物群落的影响规律与对土壤理化性质的影响规律一致，连作一年、两年、三年的花生根系土壤微生物群落存在显著差异，并且，连作两年与连作三年的土壤微生物群落结构更为相似。近年来，对连作花生土壤微生物群落结构的研究越来越多，研究证实连作确实造成花生根系土壤微生物群落结构失衡，土壤及根际真菌的数量随花生连作年限的增加而显著增加，细菌和放线菌数量则明显减少[16-17]。我们前期对花生连作过程中土壤微生物群落演替规律的研究结果也表明花生连作致使土壤微生物群落结构失衡，病原微生物尤其是真菌性病原菌的丰度和多样性增加，而有益微生物则呈减少趋势[12,15]。但目前，对花生连作过程中根系土壤微生物群落结构和土壤理化性质之间的相关性研究还很少。本研究证实花生连作过程中根系土壤微生物群落结构的变化确实与土壤理化性质的变化存在密切相关性，并且两者变化趋势对连作年限的响应一致。对连作过程中含量变化显著的土壤元素进一步与土壤细菌、真菌群落结构进行关联分析，结果表明全盐量和有效铜的含量与连作两年、三年土壤的微生物群落结构相关性强，而有效钾、有效磷、有效锰的含量与连作一年的土壤微生物群落结构相关性强，推测这些元素与土壤微生物的生长代谢密切相关，由于花生对营养元素的偏好性，使连作过程中土壤营养元素失衡，进而影响了根系微生物的生长代谢，从而使根系微生态环境发生改变，进而导致花生的生长发育受到影响。

本研究分析了花生连作过程中土壤理化性质包括pH值和土壤常量、微量元素的变化特征和连作过程中花生根系土壤微生物群落结构变化特征及其与土壤理化性质之间的相关性。结果表明，花生根系土壤理化性质和土壤微生物群落结构确实受连作影响，而受花生品种影响较小。两者对连作年限的响应规律一致，连作一年的土壤与连作两年、三年的土壤差异更为显著；并且连作过程中根系土壤理化性质的变化与土壤微生物群落结构的变化具有显著相关性。