盐度对瘤背石磺血淋巴生理生化指标及免疫应激指标的影响

沈永龙 ，陈威 ，黄金田 ，李强 ，张明明

由于瘤背石磺生活于潮间带地区，潮汐、降雨以及人类活动等均可导致潮间带盐度发生变化，从而给水生生物产生盐度胁迫，大量实验研究表明，盐度变化对水生动物生长存活、新陈代谢和渗透压调节等具有显著影响[1]，同时环境胁迫对水生生物生理机能影响首先通过水生动物体内血液生化指标和免疫指标反映出来。有关环境盐度影响水生动物血液生化指标和免疫指标变化报道很多，一般认为盐度突变能够导致甲壳动物、鱼类机体的免疫力下降。潘鲁青等[2]对对虾、李才文等[3]对日本对虾的研究表明，盐度突变使得生物体的血细胞数量降低，溶菌酶活性下降。贝类方面，马洪明等[4]认为盐度突降会使栉孔扇贝酸性磷酸酶活性升高。王帅等[5]报道了低盐胁迫使得中国血蛤非特异性免疫酶活性降低，且长期会抑制某些非特异性免疫因子。因此，可以通过检测不同盐度组瘤背石磺血液成分的变化来评价瘤背石磺的健康状况、营养状况以及对环境盐度的适应状况[6]。鉴于此，本文通过研究盐度变化对瘤背石磺血液生化指标和免疫指标的影响，从而了解瘤背石磺对环境盐度变化的适应机制，为进一步提高瘤背石磺的基础理论研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用瘤背石磺为采自盐城射阳河口区滩涂的同一批体质健康个体，经过150 mg/L KMnO4水溶液消毒5 min后采用铺设底泥、搭置瓦片等模拟自然环境的方式进行温箱养殖，暂养驯化2 d备用。

1.2 试验饲料

以螺旋藻作为瘤背石磺的饲料，使用前粉碎均过100目筛，充分混合后作为饲料，晾干保存于冰箱中备用。饲喂时以海泥作为填充物质，海泥与螺旋藻粉按照5：1比例拌饲投喂。

1.3 试验设计与饲养管理

驯化结束后，选择个体均一的健康瘤背石磺1 200 只，湿重为（2.96±1.02）g，随机分成 5 组，分别用不同盐度梯度（5、15、25、35 和 45）的人工海水饲养于特制的防逃养殖箱（70 cm×50 cm×40 cm）中，每组设置6个重复，每个重复40只。饲养期间所用海泥均为过200目筛绢网的海边高潮带表层泥土，将细海泥分别在不同盐度梯度的海水中完全浸湿5 min后铺设于养殖箱底部，厚约3 cm，然后将铺有底泥的养殖箱倾斜30°放置，形成斜坡。在每个箱中喷洒2 L相应盐度梯度的海水，使其在坡底具有一定的积水，每日添加曝气后的自来水维持积水量和箱内湿度，同时调节水体盐度，从而维持瘤背石磺生存环境中盐度的稳定。

表1试验饲料配方和营养水平 （%，干物质基础）

试验期间箱内气温控制为24～26℃、保持箱内湿度88%～90%，每天两次07：00和17：00用海泥与螺旋藻粉（m：M/20：1）拌饲投喂于固定位置的玻璃食台，投饲率为2%。每次投喂前清洁养殖箱、食台及瓦片，投喂后1 h清除残饵并向养殖箱中分别喷洒不同盐度梯度的海水，维持瘤背石磺体表湿润和养殖箱内的湿度。观察记录摄食情况并检查防逃设施是否完好。饲养60 d后，从各处理组中随机抽取瘤背石磺30只，采集组织样本测定相关指标，取样前禁食24 h。

1.4 样品制备及分析测定

1.4.1 血淋巴生化指标 饲养60 d后，禁食24 h。将从每个箱中随机取得的瘤背石磺30只用肝素钠溶液润洗后的2 mL一次性注射器抽取血淋巴。采用心脏动脉抽血，取全血置于离心管中（含有少量已烘干的肝素钠），测定总蛋白（TP，双缩脲法）和白蛋白（ALB，溴甲酚绿法）含量。然后将全血3 500 r/min离心15 min制得血清，测定血清中甘油三酯（TG，甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法）、胆固醇（CHOL，胆固醇氧化酶-过氧化物酶法）、谷丙转氨酶（GPT，赖氏法）、碱性磷酸酶（ALP，AMP法）及血糖（GLU，葡萄糖氧化酶法）含量。除血糖外，血淋巴生化指标均采用美国倍肯公司生产的ABBOTTALOYON 300全自动生化分析仪进行分析测定。1.4.2 免疫应激指标 首先取样制备瘤背石磺血清(同1.4.1)，然后分别用超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(测总)、过氧化氢酶(CAT)测试盒、还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒以及丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)分别测定不同盐度组相应招标含量。每次测量设置空白对照管、标准对照管、测定管，分别设置三个平行。蛋白定量采用Bradford考马斯亮蓝法。

SOD活力单位定义为：每1mL血淋巴在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位（U/mL）。CAT活力单位定义为：每1mL血淋巴每1s分解1μmol H2O2的量为一个活力单位（U/mL）。GSH的比含量定义为：每L血淋巴中GSH的含量（gGSH/L）。MDA的比含量定义为：每1mL血淋巴中MDA的含量（nmol/mL）。

1.5 数据统计与分析

原始数据经Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0中的单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行统计分析，并进行Duncan氏多重比较。统计结果表示为平均值±标准误（Mean±SE），P＜0.05认为差异具统计学意义。同时，Excel作图，得到各指标值随盐度水平变化的柱状图，并将血淋巴各个指标数值与增重率进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 盐度对瘤背石磺血淋巴生化指标的影响

由图1可以看出，盐度对瘤背石磺血液生化指标的影响差异显著。首先，从血清蛋白质和血液中酶类指标看，随着盐度的升高，瘤背石磺血清中的总蛋白、白蛋白和球蛋白含量变化趋势一致，即低盐度时随着盐度升高呈现下降趋势，且各组之间差异明显（P＜0.05），而在盐度35时又突然升高，后又下降。同时，血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性随盐度的升高变化趋势稍有差异，但均随着盐度的升高呈现下降趋势。谷丙转氨酶在盐度小于25时，各组之间差异不具统计学意义，但当盐度继续升高后，谷丙转氨酶活性显著下降，而谷草转氨酶和碱性磷酸酶均在盐度大于15时，其活性就显著降低。其次，从糖类和脂类的代谢产物分析，盐度对血糖和血脂的影响变化趋势不同。血液中血糖含量随着盐度的升高呈现下降趋势，且盐度15、25和35组之间无显著具统计学意义（P＞0.05），但显著低于盐度5组，显著高于盐度45组（P＜0.05）。而血脂随着盐度的升高有一定的降低，但差异不具统计学意义（P＞0.05），而胆固醇在血清中的含量呈现“波浪式”变化，且盐度5、25和45组之间差异不具统计学意义（P＞0.05）。

图1瘤背石磺饲养环境盐度水平与血液各生化指标之间的关系

续图1瘤背石磺饲养环境盐度水平与血液各生化指标之间的关系

2.2 盐度对瘤背石磺免疫应激指标的影响

本试验研究表明，盐度对瘤背石磺某些免疫应激有显著影响。从图2可以看出，过氧化氢酶在盐度15时最高，且低盐度时活性显著高于高盐度（P＜0.05）。SOD与CAT相似，均在高盐度时活性高，但不同的是，SOD在盐度15时最高，在盐度5组最低，且显著高于和低于其他各组（P＜0.05）。MDA含量与GSH相似，在低盐度时含量显著低于高盐度（P＜0.05）。GSH在随着盐度的升高，先降低再升高，但随着盐度的升高，其含量升高幅度较大。MDA含量在盐度25时最高，其次是盐度45组，其余三组之间无显著影响（P＞0.05）。

图2瘤背石磺饲养环境盐度水平与血液各免疫应激指标之间的关系

3 讨论

3.1 盐度对瘤背石磺血淋巴生化指标的影响

血液生化指标能够反映水生生物健康状况和生理状况，可作为判断生物体是否患病、患病类型和病情轻重的一种简便依据，它受内外环境以及营养状况等多种因素的影响[7-8]。盐度是与水生生物存活和生长密切相关的环境因子之一，其对机体的影响间接表现为物质交换和体内能量的流动。在盐度胁迫环境中，瘤背石磺必然需要消耗大量的能量——血糖来维持内外环境的水盐平衡。从本试验可以看出，在盐度5时，瘤背石磺血淋巴中血糖浓度最高，显著高于其他各组，这与洪磊等[9]对许氏平鮋的研究结论相似，即血糖水平与盐度胁迫强度呈一定的正相关性。但不同的是，在高盐度时，瘤背石磺血淋巴的血糖浓度较低，这可能是因为渗透压调节途径不同低盐度刺激诱导与糖异生作用相关酶活升高增加血糖浓度，而高盐度诱导产生不同的渗透压调节途径，同时也可能是瘤背石磺对于高渗溶液的渗透压调节比低渗溶液更有效的原因。

血脂是血浆中甘油三酯、胆固醇和类脂的总称，是生命细胞基础代谢的必需物质。在正常情况下，机体中甘油三酯含量和胆固醇含量具有相关性[10]。本试验发现，随着盐度的升高，瘤背石磺血淋巴中甘油三脂含量呈下降趋势，但无显著变化，这与黄晓荣研究盐度对施氏鲟的影响结果一致，但甘油三脂随盐度的升高变化具有一定差异性，并不是随着盐度的升高呈现单一的先上升后下降趋势，而是呈“波浪式”变化，具体原因还需进一步研究。

磷酸酶是生物体内的重要代谢调控酶，也是溶酶体酶的重要组成部分，在贝类非特异性免疫中起到重要作用。王帅等[5]对血蛤的研究表明，盐度胁迫对磷酸酶活性具有抑制作用，且碱性磷酸酶对盐度的反应比酸性磷酸酶小，且具有滞后性。本试验结果显示，低盐时，瘤背石磺血淋巴中碱性磷酸酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性均较高，这可能是因为低盐胁迫导致瘤背石磺某些器官，如肝脏，发生损伤，致使大量酶类释放至血淋巴中。另外，从上面的白蛋白、球蛋白以及白球比可以看出，低盐度和高盐度时，球蛋白含量显著提高，白球比显著降低说明盐度胁迫已经造成瘤背石磺免疫抑制作用。

3.2 盐度对瘤背石磺免疫应激指标的影响

盐度的变化不仅与水生生物的渗透压调节 (能量的平衡)、氧吸收和清除率相关[11-14]，还对其免疫力有显著影响，如改变盐度能显著降低日本囊对虾、凡纳滨对虾等的血细胞的数量和非特异性免疫因子的含量，从而降低其免疫力[15-17]。贝类的体液免疫没有特异性免疫，只有非特异性免疫，其抗氧化防御系统主要是由一些抗氧化因子构成，主要包括SOD、GSH-PX、CAT、GSH 以及 MDA 等，它们联合作用保护机体免受氧化损伤。另外，水解酶活性受外源刺激或胁迫的诱导，这也可能是贝类具有可增强的抗性和对胁迫的耐受的原因。在水解酶类中，SOD和CAT是一类清除机体活性氧自由基的关键酶类，是抵抗超氧阴离子及其活性产物的第一道防线。正常情况下，机体的自由基含量处于动态平衡状态。然而，环境胁迫时机体的抗氧化系统的平衡将被打破，造成水解酶活性升高。因此，抗氧化酶活性的变化也用作于指示应激的程度。对于CAT，本试验中，盐度15时活性最高，高于或低于此盐度均有所降低，说明长期的盐度胁迫对CAT有一定的抑制作用。

谷胱甘肽（GSH）在清除体内自由基和损伤修复中起重要的作用，是细胞合成的重要的抗氧化剂。MDA是机体内脂质氧化的产物，间接反映出细胞可能被氧化甚至损伤的程度。有研究表明酸性环境可以促进脂质的过氧化反应[18]。本试验结果表明，瘤背石磺血淋巴MDA含量在盐度25时最高，说明在此盐度下，瘤背石磺脂质过氧化作用明显增强，结合以上抗氧化酶活可以推断，由于盐度胁迫应激造成的MDA积累可能主要由于活性氧过量产生和积累，同时活性氧的清除体系——抗氧化酶活性低造成的。

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