动物肝损伤模型建立的研究进展

周仲强，魏恩巍

(1.吉化集团总医院 药剂科，吉林 吉林 132000；2.吉林大学 药学院，吉林 长春 130021)

肝脏是人体内主要的代谢器官，而肝损伤引起的多种肝脏疾病是严重影响人们的身体健康的常见疾病.造成肝损伤的原因有很多，包括化学性、代谢性、药物性、酒精性及环境因素等，长期的肝损伤往往会进一步发展成肝纤维化、肝硬化、肝癌及肝功能衰竭[1].肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题.构建恰当的肝损伤动物模型，是研究肝损伤的发病机制，探索新的治疗方法的基础[2].近年来对于肝损伤的治疗似乎是热点[3]，通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病发生的机制与靶点，筛选出较优的保肝药物，探索保肝的作用原理，是具有重要的现实意义.因此本文阐述了近些年动物不同肝损伤模型的概况以及相应抗肝损伤机制，对日后关于肝损伤的研究提供理论基础，具有一定的应用价值.

1 CCl4诱导肝损伤

四氯化碳(CCl4)肝损伤动物模型是最经典的试验性模型.CCl4 进入体内后,在肝细胞的内质网中经细胞色素P450氧化酶的代谢,生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基.这些自由基可与细胞内和细胞膜的大分子共价结合,使酶的功能丧失,细胞膜脂质过氧化,胞浆Ca2+浓度升高,胞浆内转氨酶渗入血液[4],导致肝细胞损伤.

Rofiee[5]等人将文定果叶子干燥粉碎后浸泡在甲醇里72h后，取上清液浓缩

后保存在4 ℃条件下.分成3个剂量组对大鼠进行灌胃处理，其中模型组给予生理盐水，最后一次给药24 h后再给予50% CCl4(按1.5 mL/kg体积给药).实验结果表明，到第八天时，大鼠的体重逐渐降低，与正常组产生一定的差异；麻醉，取血，测得生化指标(ALT、AST、ALP)与正常组相比较出现了明显的升高趋势；利用代谢组学可以观察到CCl4起到肝损伤作用的两条途径，一条是初级胆汁酸的生物合成.在一个健康的状态中大部分的胆汁酸重吸收回到肠的顶端，通过钠依赖性胆汁酸转运(ASBT)到细胞和分泌胆汁的基底门静脉，胆汁酸在到达基底膜后可以通过具有钠依赖性的牛磺胆酸钠转运体(NTCP)再次分泌到胆囊[6].然而当肝功能受损时，由于肠肝循环周期的不充分，胆汁酸过多停留在流通期间，空腹血清胆汁酸水平的含量被认为是早期肝功能不全的检查指标，同时伴有肝脏炎症[7]；另一条是花生四烯酸的代谢.环氧二十碳三烯酸(EET)是花生四烯酸代谢物，它参与多种信号通路调节炎症的发生和传播，是疼痛和稳态功能的一个关键的信号分子[8].给予四氯化碳后，肝细胞发生死亡，导致它的酶未能转换为更为稳定和低生物活性的EET羟基酸(DHETs).两条代谢途径的改变，从而释放出大量的炎症因子引起肝损伤.

2 D-半乳糖胺诱导肝损伤

Jia[9]等人探究氧化白藜芦醇调节脂多糖诱导急性小鼠肝损伤的机制.采用试剂盒测定ALT、AST、CAT、SOD、 T-AOC、 iNOS和MDA等血清指标；运用Western-blot分析方法测定相关的蛋白表达；采用苏木精-伊红染色法对固定的肝脏进行染色，利用组织病理学荧光显微镜下观察肝组织的变化.实验结果表明，通过抑制TLR4/NF-kB通路，并且活化Keap1/Nrf2通路和PI3K/Akt的信号通路，氧化白藜芦醇可减轻LPS/D-氨基半乳糖诱导的肝损伤，进而参与调节炎症因子的释放，减轻氧化应激和减少肝细胞凋亡程度；其中关于PI3K/Akt信号通路的激活与抗凋亡的作用，是一种新的见解与发现.蛋白水平表达的高低有助于确定药物起到肝保护作用的相关通路，对于深入了解氧化白藜芦醇作为一种有前途的保护肝脏天然产物起到了关键作用，同样对于药物的研发指引了更明确的方向.

D-半乳糖胺的致毒机理是在代谢过程中与体内尿苷二磷酸(UDP)大量结合形成稳定的尿苷衍生物，造成体内 UDP 耗竭，从而导致具有依赖磷酸尿苷的核酸、糖蛋白、糖元等物质的合成减少和受阻，最终导致肝损伤甚至死亡[10].因此，研究D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤具有重要的临床意义.

3 乙醇诱导肝损伤

乙醇进入体内后主要是通过肝脏来完成代谢，一旦摄入过量的乙醇，细胞色素P4502E1( CYP2E1)会被诱导参与乙醇的代谢，产生活性氧(ROS).ROS能够与生物大分子反应造成蛋白变性、酶失活、DNA 结构改变、脂质过氧化，从而造成肝细胞的损伤[11].

Bai[12]等人探究白桦脂醇调节乙醇诱导肝损伤的通路.白桦脂醇治疗组与模型组相比都能够降低血清中ALT、AST和TG的表达水平，初步说明了白桦脂醇是一种较为有效的抑制剂；HE分析的结果表明，模型组小鼠的肝组织与正常组相比发生严重的脂肪变性、炎性浸润和纤维化，肝损伤比较严重；免疫组化染色分析肝纤维化的重要特征α-SMA，模型组小鼠的门静脉区域和中央静脉周围的α-SMA表达强度远远强于正常组小鼠，而几个治疗组通过染色法分析没有检测出相应的 α-SMA，并且在Western-blot也得到了一致的结果，collagen-I和α-SMA的蛋白表达水平与模型组相比降低；为了进一步确认白桦脂醇是否能够有利于酒精在体内的代谢，对SREBP-1(固醇调节元件结合蛋白-1)的蛋白表达水平进一步探究.结果也表现出模型组SREBP-1 蛋白表达水平增加，而给药治疗组则减轻了SREBP-1表达.蛋白水平表达的高低离不开相关通路的调节，利用Western-blot方法分析出，模型组中的LKB-1和AMPK的信号表达水平降低，而在给药治疗组；则恢复到了正常水平，这也说明了白桦脂醇对于乙醇诱导肝损伤的调节通路与LKB-1和AMPK相关.

4 人源性肝嵌合体小鼠

通过预测人体药物代谢和药物动力学(PK)在药物安全有效筛选中是重要的.常用的方法包括定性筛查评估，代谢稳定性，细胞色素(P450)等参数的抑制和诱导.代谢物评价，包括使用人体生物样本的体外代谢研究，如肝微粒体和肝细胞，以及使用实验动物的体内研究.然而由于体外和体内结果不稳定以及药物代谢的种间差异，使用这些方法的预测往往是不准确的.因此，为了得到精确的预测，研究出了一个更有效的方法是开发人源化的动物，如具有人源化肝的嵌合体小鼠.人源性嵌合体小鼠是指通过将人肝细胞移植到有免疫缺陷的小鼠体内来构建基因改造，具有免疫缺陷的小鼠有利于将人类细胞植入小鼠肝脏并且防止移植的人类细胞产生排斥反应而损伤内源性小鼠细胞[13].小鼠肝细胞的大部分被人肝细胞取代，从而表达人类药物代谢酶[14].因此，这些人源性嵌合体小鼠的药物代谢和PK研究可用于改善这种药物预测.

有三种常用的人源性嵌合体小鼠[15].第一种为尿激酶型纤溶酶原活化剂(UPA)严重联合免疫缺陷人肝细胞移植(SCID)小鼠，UPA代表尿激酶型纤溶酶原激活物，是一种丝氨酸蛋白水解酶，主要作用是用于组织重建，SCID代表重症联合免疫缺陷，由于小鼠自身肝细胞代谢具有缺陷，所以移植的肝细胞更容易存活，并且肝细胞置换率(RI)能达到80%.但是由于删除了原UPA而导致RI逐渐减少.为了解决这个问题，Tateno[16]等人构建半合子基因uPA NOD/SCID小鼠，能够使RI保持在一个较高的状态.Hasegawa[17]等人构建了第二种TK-NOG人源性小鼠，这类小鼠具有单纯疱疹病毒1型胸苷激酶的基因，在高度免疫缺陷NOG小鼠肝脏产生高度表达.通过更昔洛韦来消融小鼠肝细胞，随后将肝细胞移植并保持在TK-NOG小鼠体内的肝脏，进而构建成人源性嵌合体小鼠.Azuma[18]等人构建了第三种 Fah//Rag2/Il2rg/(FRG)小鼠.延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)是参与酪氨酸代谢途径的最后一个酶，Fah基因缺失导致有毒产物的积累，进而损伤小鼠肝细胞，造成免疫缺陷后将人类的干细胞移植到小鼠体内，并且维持一个很高的置换率.

为了检查人类的转运蛋白(mRNA)表达水平及其药物代谢酶活性，通过对比人类的CYP1A1基因，结果表明人源化肝UPA/SCID小鼠的CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4与供体相似；Katoh[19]等人报道了人类肝细胞中主要蛋白质和酶的活性，结果显示肝脏中的磺基转移酶(SULT)、N-乙酰基转移酶和谷胱甘肽-S-转移酶在人源化UPA/SCID小鼠体内的RI接近90%，表明UPA/SCID小鼠的蛋白表达水平与人类肝脏蛋白表达是相似的.因此，人源性肝嵌合体小鼠可保留人类肝脏中具有药物代谢功能的相关酶和转运蛋白[20，21].

5 结语与展望

近年来，人们对肝损伤认识的不断深入，有关肝病的起因，防治等各方面的研究也日渐增多.伴随着肝保护作用研究的深入，对各种类型所引发的肝损伤研究有待成为热点.为了深入地研究肝损伤及其相关疾病，就需要建立相应的动物模型，从而筛选出治疗和防止肝病的有效药物，同时选择一种理想的实验动物损伤模型也是十分重要的.理想的损伤模型应具备与人类疾病特征相似，病变有一定发展过程并且造模死亡率低和简便易行.因此选用CCl4、D-半乳糖胺、乙醇和人源性嵌合体小鼠等其它损伤模型具有一定的优势.其中人源性嵌合体小鼠的使用价值非常高，尽管价格昂贵，但能够更加准确地预测出药物的安全性与有效性，并且能够较好的表现出药物在体内的代谢分布，这种动物模型同小鼠损伤模型有一定的区别，主要在于肝细胞分布的酶及其相应的蛋白表达，人源性嵌合体小鼠肝细胞能够最大化的反映出人肝细胞所具有的酶.目前国内很少采用人源性嵌合体小鼠的方法构建动物损伤模型，有待于不断探索.随着研究的深入，动物损伤模型的建立也会更加适应于人类自身所具有的相关条件，以此来推动药物行业的发展，为人类的健康做出更大的进步.