钙离子在内质网应激中的作用

李 铭，邹 颖，郭 寒，常仁旭，葛婧昕，杨 威，陈媛媛，夏 成，张洪友，张冰冰，徐 闯*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319)

内质网(endoplasmic reticulum，ER)广泛存在于除哺乳动物成熟红细胞以外的各种真核细胞中，属于真核细胞中精细的膜系统。内质网膜系统是细胞加工蛋白质、脂质及贮存钙离子的主要场所，是分泌途径的第一步。对于大多数分泌和跨膜蛋白来说，其新翻译的未经折叠的蛋白经过富有钙离子与折叠酶环境的内质网进行初步的加工形成稳定的三级结构，且蛋白质在内质网腔中只有被正确的构象与修饰，才能转运至高尔基体内进一步加工[1]。而错误折叠的蛋白质在内质网中则被相应的蛋白解体酶降解。Ca2+参与细胞内许多重要生理过程，如转录因子的激活、细胞质增殖与凋亡、蛋白质的修饰等。Ca2+的储存和信号传导是内质网重要功能之一。Ca2+在体内的浓度受到非常严密的调控时，机体才能处于较稳定的状态；当Ca2+浓度紊乱，机体则会发生很多不利反应。细胞内外Ca2+浓度梯度差异是Ca2+作为胞内第二信使的前提和重要条件。而这种情况主要是由内质网Ca2+-ATP酶泵(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCAs)产生的。内质网还在脂质生物合成中起核心作用并产生磷脂、胆固醇、三酰甘油和神经酰胺等。胆固醇合成的限速酶在内质网膜上。当胆固醇水平下降时，内质网中的固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)被激活，从而上调胆固醇表达，硬脂酰辅酶A脱氢酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)催化饱和游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)去饱和[1]。丝氨酸棕榈酰转移酶，即从头合成神经酰胺的限速酶，也位于内质网膜上。

1 内质网应激

内质网功能的正常发挥是细胞存活的必要条件。不论是正常的生理变化还是对环境的适应表现，蛋白质表达量的变化大都是通过内质网的调节来实现的[2]。由于游离胆固醇与磷脂比率和饱和游离脂肪酸含量较低，因此内质网膜是细胞膜中最流动的膜之一[3]。由于内质网膜有序性的增加而引起膜流动性的损失，导致Ca2+消耗和蛋白质错误折叠。在缺氧、药物作用、自由基侵入、Ca2+稳态失衡等刺激下，内质网的正常功能被打乱，大量蛋白质被错误的折叠，导致大量未折叠蛋白质(unfolded protein，UP)堆积在内质网中，促使内质网启动应急机制来缓解未折叠蛋白产生的压力，这个过程称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。内质网应激是一种重要的细胞自我防御机制，内质网应激时最先启动生存途径，但长时间的内质网应激将导致细胞启动凋亡途径[5]。内质网应激也是一种病理机制，如突变体表达蛋白质紊乱，内质网伴侣水平或Ca2+含量不足，氧化还原或ATP状态改变，内质网磷脂消耗和胆固醇积累。内质网应激与帕金森病、骨质疏松症、癌症、退行性神经疾病均相关。此外，肝细胞中含有大量的内质网，许多肝脏疾病均与内质网应激及其介导的细胞凋亡相关，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、药物性肝病、急性肝衰竭、肝癌等[6]。内质网应激是由未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)、内质网相关性凋亡和整合应激反应这3种反应相互关联的动态过程，主要为未折叠蛋白反应[7]。UPR的主要目的是减少未折叠的蛋白质负荷并恢复细胞器的稳态。为此，UPR减少蛋白质翻译并诱导参与折叠、N-糖基化、内质网相关降解、质量控制、氧化还原及脂质生物发生的内质网中的转录等。

内质网膜上存在着3种内质网跨膜受体感应蛋白分别是肌醇依赖酶1(inositol requiring enzyme1,IRE1)、RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶(pancreatic elf-2 kinase pancreatic ER kinase，PERK)和激活转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[8]。IRE1α具有蛋白激酶活性和位点特异性内切核糖核酸酶(RNase)活性。PERK还具有蛋白激酶活性并起到磷酸化真核翻译起始因子2α(eukaryotic Initiation Factor 2α，eIF2α)的α亚基作用。ATF6是属于cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和ATF家族转录因子的碱性亮氨酸拉链(basic region/leucine zipper motif，bZIP)-结构域转录因子。在静息细胞中，ERS受体通过与ER分子伴侣GRP78/Bip结合而处于未激活状态，一旦大量的未折叠蛋白聚集，GRP78/Bip便与这3个受体解离，去结合异常的蛋白。且膜受体蛋白解离后发生专属激活通路，IRE1与PERK发生二聚化与自身磷酸化，当ATF6从内质网膜转运至高尔基体后经过特异蛋白酶裂解形成激活的ATF6，从而触发UPR。

当PERK从Bip释放后，对ERS最直接的反应是PERK的同型二聚化和反式磷酸化，同时PERK磷酸化eIF2α。eIF2α的磷酸化抑制80 S核糖体的组装，并因此抑制蛋白质的合成。该途径通过阻止额外新生多肽进入已经饱和的ER腔而促进细胞存活。同时IRE1α发生自磷酸化，从而激活其核糖核酸酶活性。然后从编码X盒结合蛋白1(X box bindging protein1，XBP1)的mRNA开始除去26碱基内含子，使XBP1具有作为转录因子的有效活性[9]。

当ATF6从BiP释放时，它转移到高尔基体中被第1位点蛋白酶(site-1 protease，S1P)和第2位点蛋白酶(site-2 protease，S2P)切割。该过程导致ATF6的功能性(含bZIP)片段释放到胞质中。这个片段然后迁移到核并激活转录[10]。值得注意的是，S1P和S2P还能切割胆固醇和脂肪酸生物合成所需的ER相关甾醇调节元件结合蛋白[10]。切割的ATF6和活性XBP1亚型功能相似，以诱导编码ER伴侣蛋白和促进蛋白质折叠、成熟、分泌及ER相关蛋白降解酶基因的转录。然而，如果细胞不能解决蛋白质折叠缺陷并恢复内质网中的稳态，则UPR将启动凋亡，通过去除产生错误折叠或功能障碍蛋白质的应激细胞来保护机体[11]。

ERS诱导的细胞凋亡主要由C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)介导，但是CHOP诱导细胞凋亡的机制仍然不清楚。然而，已经显示CHOP诱导促进应激细胞中的蛋白质合成和氧化应激的许多促凋亡因子(如TRB3，BIM和GADD34)的表达[12-13]。

2 内质网中钙离子的作用

Ca2+的动态平衡是细胞保持正常结构和功能的前提与基础。内质网是细胞内的重要钙库，通过维持细胞内外Ca2+浓度的平衡来调控内质网功能、膜转运及保持内部环境稳态。细胞内Ca2+水平是由钙库内质网释放介导的。Ca2+作为细胞内重要的第2信使分子，参与了细胞增殖、分化、运动、肌肉收缩、激素的分泌糖原代谢及神经元兴奋性等生理活动，进而调节基因和蛋白的表达、分泌、代谢和凋亡[14]。虽然目前对细胞凋亡有很多机制尚不明确，但是研究显示当内质网中Ca2+稳态遭受破坏时，可以启动细胞早期凋亡信号。在静息状态下内质网中的Ca2+浓度高于细胞质中Ca2+浓度，蓝尼啶受体(ryanodinereceptor，RyR)、1，4，5-三磷酸肌醇受体(inositol-1，4，5-triphosphatereceptor，IP3R)和钙泵3种位于内质网上与Ca2+的释放和摄取密切相关的通道是内质网维持Ca2+稳态的主要因素，对于维持细胞内Ca2+动态平衡有着重要的作用[15]。在生理状态下，内质网中的Ca2+大部分呈游离状态，由RyR和IP3R两种受体负责将Ca2+从内质网腔中释放到细胞质内，然后钙泵又将胞质中的Ca2+摄取回到内质网中，该过程持续进行，使Ca2+保持着动态平衡[15]。游离的Ca2+在内质网中具有较高的作用，它的变化几乎关系到细胞内所有的反应，小到细胞收缩、胞吐，大到基因、蛋白表达和细胞死亡。当大量Ca2+从内质网中释放出来后可以激活钙调蛋白分解酶、死亡相关蛋白激酶，最终可以导致细胞发生凋亡。

3 钙池引发钙离子的内流

细胞内主要储存Ca2+的细胞器为内质网，浓度约为400 μmol/L[16]。参与Ca2+浓度调控的通道蛋白主要有两种功能：①诱导细胞外钙离子进入细胞内;②诱导细胞内Ca2+的释放[17]。而胞内钙池引发钙离子内流(store-operated Ca2+entry，SOCE)广泛存在于兴奋细胞与非兴奋细胞之间，是细胞摄取外源Ca2+的主要方式之一，相对的在非兴奋细胞中起着更重要的作用。Ca2+通透性受体调节通道(ROCs)和钙池引发的钙离子进入(SOCE)是调控其细胞内钙离子浓度Ca2+的主要通道。目前认为ROCs引起的Ca2+升高是一个瞬时变化，不足以维持细胞的长期反应，SOCE则可持续升高Ca2+，而Ca2+持续升高是胞内多种激酶激活的必要条件[18]。SOCE被内质网内腔Ca2+浓度降低激活而开放，生理作用在于补充内质网的Ca2+而避免钙库Ca2+耗竭。间质相互作用因子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和钙释放激活钙通道蛋白1(calcium release-activated calci-umchannel protein 1，Orai1)是目前已确定的SOCE组成蛋白，STIM1为内质网上Ca2+浓度感受器，Orai1是SOCE在细胞膜上的孔蛋白[19]。当内质网内钙池消耗后，STIM蛋白偶联并活化Orai蛋白，SOCE通路开放形成内向的Ca2+流以补充消耗的Ca2+。这对于维持细胞内的钙稳态起着至关重要的作用，也保证了细胞内Ca2+传递的准确性。

STIM蛋白是存在于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，目前研究发现其存在STIM1和STIM2蛋白2种亚型，其在氨基酸序列上存在着高度的同源性[20]。STIM1和STIM2蛋白在细胞之中存在着通过与Orai蛋白竞争性结合来发挥其各自的功能的竞争关系。研究显示在大多数细胞中，STIM1蛋白的表达量高于STIM2蛋白，且STIM2蛋白与STIM1蛋白相比较对Orai蛋白的激活能力较弱[21-22]。因此STIM1蛋白在Ca2+的信号转导中起着重要的作用。STIM1蛋白N端含有EF手性结构域和SAM(sterile α- motif)结构域组成的区域能够感受内质网内钙池Ca2+浓度的微小变化并引发分子间的相互作用[23]。STIM1蛋白C端结构域能够跨过内质网和细胞膜。也包含具有活化功能的SOAR(STIM-Orai activating region)结构域，该结构域可介导Orai蛋白与STIM1蛋白结合使SOCE通路开放[24]。静息状态下，STIM蛋白可能以二聚体的形式广泛分散在整个内质网中。在钙池消耗后数秒内，STIM1蛋白快速聚合化并移动至内质网近细胞膜区以结合并活化Orai蛋白。

Orai蛋白广泛表达于多种细胞中。在哺乳动物中，它有3种同源蛋白Orai1、Orai2及Orai3，3种蛋白的一级结构非常相似，是一个定位于细胞膜的4次跨膜蛋白，且其N端和C端均位于胞浆一侧。静息状态下Orai蛋白多以二聚体的形式存在于细胞膜表上，当钙池耗竭时，由于STIM1蛋白的激活使得Orai1由二聚体聚合为四聚体形成CRAC通道。Orai1、Orai2和Orai3都有mRNA表达，3种Orai以同源二聚体、同源多聚体、异源多聚体形式存在于细胞膜上[25]。研究发现，当Orai2蛋白和Orai3蛋白与STIM1共同表达时均能形成Ca2+通道并且显示出类似于Orai1与STIM1的共表达产生的Ca2+释放激活的钙电流(calcium release-activated calcium current，ICRAC)的电生理特性[26]。所有Orai蛋白均可增加SOCE，Orai增强SOC的作用由高至底依次为Orai1、Orai2、Orai3，其中Orai3能补偿Orai1缺乏时的功能[27]；STIM1并不进入细胞膜中，而是在距离细胞膜约10 nm～25 nm范围内与Orai蛋白相互作用。

SOCE的过程具体步骤为：细胞在静息状态下，STIM1蛋白在均匀的分布在内质网膜表面，STIM1蛋白位于内质网中的cEF手性结构域结合充足的Ca2+形成稳定的结构域[28]。当内质网内的Ca2+浓度较低时Ca2+从cEF手性结构域中解离引起稳定的结构域的展开从而使STIM1蛋白构象变化并发生多聚化，并激活Orai1蛋白，引发钙内流从而补充钙池，当钙池内的Ca2+浓度恢复后STIM1蛋白迅速的与Orai1蛋白分离，Orai1通道也相应的关闭。

4 展望

钙离子是重要的细胞内第二信使，参与细胞的多种生理病理过程，肝细胞在生理浓度的激素作用下可引起Ca2+持续升高，在生理状态下，钙离子信号调节肝细胞的多种生理功能。研究表明，内质网应激及其介导的细胞凋亡与肝病的发生发展密切相关，对内质网应激作用机理的研究，既可以进一步了解细胞在应激状态下的自我调控能力，还可以进一步了解肝病的发生机制，从而对疾病采取一些新的干预、治疗措施，达到预防和治疗疾病的目的。如通过应用一些细胞毒性药物诱发Ca2+升高导致内质网应激，加速癌细胞的凋亡来治疗癌症，也可以应用一些药物或者细胞因子来阻断疾病，减少甚至逆转细胞的凋亡，达到保护作用，但是Ca2+诱导的内质网应激引起的细胞损伤在疾病中扮演了多大的作用尚不清楚，干扰药物的研究也仅仅处于起步阶段，有关Ca2+诱导的内质网应激的作用需要更多的研究予以证实。