猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒疫苗研究进展

吴忆春

(滨州职业学院生物工程学院，山东滨州 256603)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)能引起猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，PRRS是一种高度接触传染的猪传染病[1]。临床主要表现为母猪发热、厌食及妊娠猪发生繁殖障碍性疾病如后期流产、返情、产弱仔及木乃伊胎，各种年龄猪严重呼吸道疾病[2]，发病率和病死率高。PRRS是一种免疫抑制病，损害猪免疫机能，易继发其他复杂的猪病。1987年，PRRS首次在美国发生[3]，1991年，荷兰学者首先分离到PRRSV[4]，随后，在世界各地广泛流行，仅澳大利亚、瑞典、挪威等少数国家没有该病[5]。PRRS对当前世界养猪的危害十分严重。我国的第1株PRRSV于1996年由郭宝清分离。2006年，我国暴发了高致病性PRRS。2012年，周峰等率先报道成功分离出高度变异的类NADC30 PRRSV 毒株，该毒株毒力较高致病性毒株稍弱，但该毒株非常容易与其他毒株重组，并在我国多个地区流行，现有疫苗不能对该毒株提供有效的保护[6-7]，使PRRS的防控工作更加复杂。世界动物卫生组织规定PRRS是一种必须报告的动物传染病[8]，我国将高致病性猪蓝耳病列为一类动物传染病。PRRSV可分为2个基因型，即美洲型和欧洲型[9]，代表毒株分别是VR-2332和LV株。2种基因型之间核苷酸序列的同源性很低，大约60%左右。二者引起的猪临床症状和病变类似，但没有交叉保护性，也不会发生基因重组。我国PRRS主要流行的基因型为美州型，近年来欧洲型PRRS感染增多。PRRSV很容易发生变异，不同美洲型病毒很容易发生重组，产生新的病毒株。不同PRRSV毒株对猪的致病性不同，同一PRRSV毒株对不同猪的毒力不一。

猪是PRRSV的唯一自然宿主，潜伏期最长的37 d，最短的3 d。各品种和日龄猪均可感染发病，妊娠猪和未断奶仔猪受到的危害最为严重。本病传染源是病猪和带毒猪，可经水平传播和垂直传播两种途径传播。病毒可通过唾液、鼻液、粪便、尿液、乳汁等排出体外[10]，污染饲料、饮水等，通过呼吸道、消化道等传播，病毒可通过空气传播9 km，公猪能通过精液感染母猪，公猪精液排毒为间断性排毒，有时猪病毒血症消失后仍然能排毒，最长排毒时间可达3个月。母猪能将病毒传给仔猪，致仔猪带毒、排毒。

1 病毒基本信息

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属[11]，病毒粒子呈球型，直径55 nm～60 nm，有囊膜，表面有纤突。病毒核衣壳呈20面立体对称，内含单股线状正链RNA[12]，基因组全长约15kb，包括9个开放阅读框架(open reading framework，ORF)，即ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[13]，编码16个结构蛋白和8个非结构蛋白[14]。ORF1a、ORF1b主要编码非结构蛋白，约占整个PRRSV基因组全长的的80%左右，经蛋白酶裂解后可产生14个非结构蛋白，其中NSP2的氨基酸序列在各毒株间差别最大。其余ORF均编码结构蛋白，其中最容易出现变异的基因是ORF3和ORF5。基于ORF5基因，PRRSV美州型被分为8个不同的谱系，我国主要流行的是谱系1(类NADC30)、3(类QYYZ)、5(类V2332)、8.3(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)。不同谱系可重组，谱系间基因同源性低，谱系内同源性不一，谱系1最低，谱系5、8.3较高。其中ORF5、ORF3、ORF6和ORF7基因在免疫原性方面研究的比较深入。其中ORF5基因编码GP5蛋白，是病毒的主要结构蛋白之一，免疫原性好[15]，可诱导机体产生中和抗体，并对病毒的持续感染具有重要作用[16]。ORF6可编码膜基质蛋白M蛋白，具有很强的免疫原性，与细胞免疫有关。PRRSV对外界环境抵抗力弱，37℃ 12 h病毒死亡一半，48 h后病毒可全部死亡，56℃ 病毒丧失感染性。病毒在干燥环境也能很快失活，低剂量乙醚和氯仿等常用消毒剂可迅速杀灭病毒。病毒适宜存活的pH范围是6.5～7.5，超出此范围病毒也可迅速灭活。PRRSV具有专嗜巨噬细胞的特性，不能凝集红细胞。PRRS中和抗体水平较低时能促进病毒的增殖，甚至促使已经致弱的疫苗毒毒力返强的特性，也称为抗体依赖的感染增强作用(antibody dependent enhancement，ADE)效应，给PRRS的防控造成了困难。PRRSV具有持续性感染的特性，猪群一旦感染，很难根除，PRRSV在猪体长期存在，猪只没有明显的临床症状，并在猪群免疫力低下的时候不定期排毒。但是PRRSV并不能在猪体内终生存在，最多可持续存在250天，可采取封群并配合相应疫苗免疫的方法获得PRRS阴性猪场。

2 病毒样颗粒

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是由体外表达的病毒结构蛋白(一种或几种)自行组装成的一种空心蛋白颗粒[17]。外观与天然病毒粒子类似，内部无核酸，不能增值，无致病性。直径约20 nm～150 nm[18]，具有很好的免疫原性[19]，免疫剂量小，免疫后能诱导体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫。可将VLPs制成一种亚单位疫苗，可通过一定的检测方法区分疫苗免疫和自然感染产生的抗体。20世纪80年代专家学者开始研究VLPs，迄今为止，已经研制了近40种病毒的的VLPs，如黄病毒科病毒、细小病毒科病毒、杯状病毒科病毒、圆环病毒科病毒、小RNA病毒科病毒、乙型肝炎病毒、呼肠病毒科病毒、新城疫病毒、人免疫缺陷病毒、传染性法氏囊病毒、流感病毒等。VLPs的正确组装受到多种理化因素的影响，如蛋白浓度、pH、离子强度和温度等。VLPs模拟病毒粒子天然构象，表面存在高度重复序列，容易被免疫系统识别。

体外制备表达VLPs的系统有原核表达系统和真核表达系统[20]，主要是将病毒的一个或多个结构蛋白基因克隆到相应的载体中，构建重组载体，再将其转化原核表达用菌种，或通过脂质体等介导转染相应细胞，使外源重组蛋白高效表达，蛋白可自行组装成VLPs。目前采用的真核蛋白表达系统有4类，分别是酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统。原核表达系统是相对真核表达系统来说，优点是原理、操作均简单，成本不高，缺点是不能正确修饰所表达目的蛋白，因表达的蛋白量大，往往包涵体形式存在，不利于VLPs的正确组装，仅适用于表达少数无囊膜病毒单个结构蛋白制备VLPs，对无囊膜病毒多个结构蛋白VLPs的制备，如呼肠病毒科病毒需要选择真核表达系统。2011年，我国自主研制的由大肠杆菌制备戊型肝炎VLPs疫苗正式批准生产，这是全球第一个戊肝疫苗，免疫效果良好，并具有很好的安全性。普莱柯生物和青岛易邦分别采用大肠埃希菌表达系统制备了猪圆环病毒VLPs。真核表达系统适用范围广，对病毒是否存在囊膜制备VLPs时无明显差别。杆状病毒表达系统是目前最常用的表达系统，其主要优点是能同时表达多种蛋白，且能对蛋白加工修饰，促使蛋白成熟，变为有生物活性蛋白，又因杆状病毒不能在哺乳动物细胞中复制，所以安全性很好。2000年，德国拜尔公司和美国默克公司分别用杆状病毒表达系统研制了猪瘟病毒VLPs。勃林格、默克公司、先灵葆雅和武汉中博分别用杆状病毒系统研制了PCV2 VLPs疫苗。哺乳动物细胞表达系统能很好地对表达后的蛋白加工修饰，保持蛋白的天然构象和活性，但该系统多依赖质粒而非病毒表达，蛋白表达所需时间长，表达的蛋白量低，工艺复杂，价格昂贵，不适宜大规模生产。酵母表达系统主要还是用于制备无囊膜病毒的VLPs，酿酒酵母和毕赤酵母是常选用的宿主菌。也能对所表达蛋白进行简单修饰，蛋白表达量大，成本低，但因酵母细胞壁厚，表达的VLPs很难分泌出来，更适合无囊膜病毒VLPs的研制。1986年，默克公司研发了世界上第一个基因工程疫苗乙型肝炎病毒VLPs疫苗，它由酿酒酵母系统表达制备，颗粒直径约22 nm左右，接种该疫苗后，90%的人产生了特异性乙肝抗体。2006年，葛兰素史克公司用杆状病毒系统研制了人乳头瘤病毒(HPV)VLPs，默克公司则用啤酒酵母表达系统研制了HPV VLPs疫苗，获批上市，用于宫颈癌的预防，临床应用显示，其效果良好。植物表达系统常用于表达外源蛋白的植物有烟草、苜蓿、马铃薯、菠菜及拟南芥等，可对表达的外源蛋白进行适当的修饰，该系统可大量制备无囊膜和有囊膜病毒的VLPs，生产成本低。

3 猪繁殖与呼吸综合征商品化疫苗

目前，对发生PRRS的猪场，没有十分有效的治疗措施。猪场主要是通过对健康猪只接种疫苗进行预防PRRS。所用的商品化疫苗主要还是传统的全病毒抗原疫苗，包括灭活疫苗和弱毒活疫苗。灭活疫苗是对培养的PRRSV进行灭活，加入一定比例的佐剂制备而成，适合种猪使用。通常需要注射两次以上，且抗原含量足的情况下，才能产生足够的抗体，灭活疫苗不能刺激机体产生细胞免疫应答反应。虽然安全性高，但能产生的保护的时间非常短，多年来实践表明PRRS灭活疫苗效果不理想。PRRS活疫苗一般都是将强毒的PRRSV亲本毒株多次传代致弱后获得，亲本毒株的毒力越强，传代后制备的弱毒活活疫苗的免疫原性越好。弱毒活疫苗免疫剂量小，免疫效果较灭活疫苗好[21]，保护时间长，但活疫苗存在毒力返强的风险，怀孕后期的母猪免疫后可能会流产。

无论是PRRS灭活疫苗还是弱毒活疫苗都不适合做疾病暴发后的紧急接种免疫，只能免疫健康猪，做PRRS的预防，体弱猪接种活疫苗也有可能会发病。制备灭活疫苗采用的毒株有2种，即NVDC-JXA1株和CH-1a株，经典弱毒活疫苗的毒株有3种，分别是由CH-1a强毒致弱获得的Ch-1R株，2007年获得新兽药证书，由勃林格研制的VR2332株，2005年进入中国市场，是国内第1个正式批准上市的PRRS疫苗，由南京农大和瑞普生物联合研制的R98株，该毒株是由自行分离的PRRS强毒株，连续细胞传代80代致弱后获得，该毒株与VR2332株的同源性在99.5%以上。高致病性PRRS疫苗的毒株有4种，2011年获批的有3个，中国动物疫病预防控制中心等研制的JXA1-R株、哈尔滨兽医研究所等研制的HuN4-F112株、北京健翔和牧生物等研制的TJM-F92株，2015年由中国兽医药品监察所研制的GDr180株获批。猪场选用活疫苗时，尽量选取与本场流行的毒株同源性高的毒株进行预防，禁止频繁换用不同活疫苗毒株，不同毒种混用会导致毒力返强的可能性增大。疫苗使用后减轻猪的临床症状，缩短病毒血症时间，降低排毒，提高猪只感染病毒所需的剂量，但不能阻止感染的发生。猪场可存在多种不同基因谱系的病毒，猪场流行毒株谱系的多样化，给PRRS防控增加了难度，疫苗只对同基因谱系病毒产生保护，不同谱系病毒间交叉保护力弱。PRRS活疫苗主要适用于感染压力大的猪场，阴性猪场和妊娠后期的母猪一般不建议使用，由于传统疫苗的种种缺陷，因此，人们对安全性高、效力好，适合各种猪只免疫的新型疫苗有很强烈的需求。

4 猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒疫苗

VLPs疫苗在其他某些疾病的防控中已经被开发成商品化疫苗，临床应用效果良好。科研工作者也在PRRS VLPs疫苗的研制上进行了一些探索，并取得了一定的成绩。当前研究显示PRRS VLPs的形成需要2种以上的蛋白的参与。用杆状病毒表达系统制备的含PRRSV GP5蛋白和M蛋白的VLPs，VLPs大小约50 nm，免疫活性与天然蛋白无任何差别，不同剂量的VLPs免疫小鼠后，效果不同，但均有一定免疫活性[22]。也有研究表明GP2b在促进VLPs的释放中起重要作用。PRRSV的免疫原性基因也可以与其他不同病原的免疫原性基因嵌合成VLPs，能同时防控多种病原。Wang、Xue等制备了嵌合猪流感病毒(SIV)和PRRSV 主要免疫原性蛋白的VLPs，动物免疫试验发现，该嵌合VLPs将是一种潜在的针对PRRSV和SIV的安全、有效的候选疫苗，能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答反应。吕凤林等制备了由猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和PRRSV主要免疫原性蛋白构成的VLPs，并经肌注、饮水、滴鼻等不同途径免疫猪，检测其免疫效果，结果显示，该VLPs可同时刺激猪只产生针对3种病原的体液免疫和细胞免疫应答反应，且对各阶段猪安全性好，具有良好的应用前景，可实现一苗防多病，为新型疫苗的研制奠定了基础。采用大肠埃希菌表达系统表达了乙型肝炎病毒核心蛋白与PRRSV GP5融合蛋白，可自主装配形成VLPs，体外试验表明，该VLPs能抑制PRRSV对细胞的感染，VLPs浓度越高抑制效果越好[23-24]。用一种新型的杆状病毒表达系统制备了含PRRSV GP5-GP4-GP3-GP2a-M蛋白的VLPs，用PLGA纳米粒包埋后，滴鼻免疫猪后进行攻毒，检测免疫效果，结果显示，免疫接种后，猪体能同时产生体液免疫和细胞免疫，且能明显减少猪肺中的病毒载量[25]。PRRS VLPs疫苗研究刚刚起步，至于PRRSV哪种蛋白更能促进VLPs的形成，并保持良好的免疫原性，以及哪种佐剂能提高免疫效果都需要进一步探索。

5 小结与展望

PRRS是当前对全球养猪业危害最严重的疾病之一，可损害猪免疫器官，造成猪只免疫抑制，对其他疾病的易感性增加。当前所用灭活疫苗保护力有限，活疫苗存在毒力返强的风险，对是野毒感染还是疫苗免疫抗体不能鉴别。PRRSV存在抗体依赖的感染增强作用(ADE)现象；且极易发生变异，不同类型毒株没有很好的交叉保护，给传统疫苗的研制造成了困难，迫切需要研制一种新型疫苗防控该病。VLPs疫苗是当前新型疫苗研究的热点，安全性好，能诱导机体同时产生两种不同的免疫应答反应，即体液免疫应答和细胞免疫应答，科研工作者研制了一些VLPs疫苗，并实现了产业化，免疫效果也得到了广泛的认可，但由于种种原因，真正商业化的VLPs疫苗产品很少。PRRS VLPs疫苗研究取得了一些成绩，但要想真正的产业化还有大量的工作要做，如基因序列的选择与优化，表达系统的选择，表达量的提高，VLPs的大规模纯化，成本的降低，佐剂的选择和添加比例，如何评估疫苗效力等。相信随着研究的不断深入，不久的将来，PRRS VLPs疫苗研发必将取得突破性进展，从而为PRRS的防控提供有利的工具。