水貂阿留申病胶体金免疫层析试纸条与对流免疫电泳对比试验

刘 洁，李 伟，任二军，刘进军，韩学良

（石家庄市农林科学研究院，河北石家庄050041）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink，AD)又称浆细胞增多症，是由细小病毒科的水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起水貂的一种慢性、消耗性、免疫抑制性传染病。成年水貂病理变化及临床症状为高免疫球蛋白血症、动脉炎及肾小球肾炎，水貂皮张质量及繁殖能力下降，容易继发其他疾病，幼貂常发生急性间质性肺炎甚至死亡[1]。目前没有有效的疫苗预防，也无特效药治疗，所以对貂群进行快速高效灵敏的检测从而消除AD抗体阳性水貂就成了控制该病最有效的方法。目前国内外研究出诊断AD检测方法主要有碘凝集实验、对流免疫电泳（Counter Immunoelectrophoresis,CEP）、基因芯片法、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、胶体金免疫层析试纸条(gold immunochromatography assay,GICA)、荧光定量PCR法等。本试验利用GICA和CEP两种方法对河北某貂场随机采取的血清样本进行检测，并对二者的符合情况及检测成本进行比较。

1　材料

1.1　试验动物

随机选取河北某貂场笼养水貂192只。

1.2　仪器

电泳槽及电泳仪（北京六一厂）、微波炉、电子天平、移液器（eppendorf），打孔器、砂轮、注射器针头、玻璃板（10cm×10cm×1mm）、100ml锥形瓶、肝素钠抗凝毛细采血管(20ul)、毛细管盒、工业橡皮泥、剪指刀。

1.3　试剂

CEP诊断抗原和阳性血清来自丹麦进口分装；电泳缓冲液（Tris base 2.408g，巴比妥钠 4.064g，巴比妥 1.024g，溶于 500mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至8.4-8.6）；1.0%琼脂糖凝胶；ADV抗体胶体金快速检测试纸条（货号：9903）由北京纳百景奕（NBGen）生物科技有限公司提供。

2　方法

2.1　血样采集

一人保定水貂，一人用剪指刀剪掉水貂趾甲，用毛细采血管采血，虹吸至2/3处，用工业橡皮泥封口，放入毛细管盒，并做好标记。常温或4℃冰箱过夜放置自然分离血清。

2.2　试纸条检测

2.2.1　样品准备

将采血梳用记号笔编号，写清笼舍号，采血后，按标记顺序粘贴在标记好的采血梳粘性凹槽内，并对齐下沿，以便后期操作。

2.2.2　操作步骤

根据待检样本数量，取出足量的反应微孔，将其放置于微孔架上备用；用滴管向微孔中加入标记刻度量的ADV快速检测稀释液 （约100ul），将下端对齐的采血梳按标记顺序插入反应微孔，可稍微晃动，以保证血样充分溶解；浸泡两分钟后，取出采血梳；插入待检试纸条，计时5min；用剪刀剪掉吸水端，终止反应。

2.2.3　结果判定

质控线（C线）显色，检测线（T线）不显色，结果为阴性；质控线（C线）显色，检测线（T线）也显色，结果为阳性。

2.3　对流免疫电泳检测

实验方法步骤及结果判定参考本课题组之前发表文章[2]。

3　结果

CEP和GICA两种检测方法的阳性检出率见表1，符合率见表2。从表1可以看出，GICA的检出率为57.81%，CEP检出率为56.25%，GICA的检出率比CEP高1.56%。从表2可以看出，CEP阳性的GICA检测全部为阳性，CEP阴性、GICA阳性的为3只，不符合的数量为3只，GICA和CEP检出都为阳性的108只，都为阴性的81只，符合数是189只，符合率是98.44%。

表1　对流免疫电泳与试纸条的阳性检出率

表2　对流免疫电泳与试纸条的符合率

4　讨论

1972-1974年Cho等在加拿大首次应用CEP诊断AD，该方法原理是利用ADV抗体（被检水貂血清）和抗原（脏器或细胞抗原）在电场作用下进行反应，抗原由阴极向阳极移动，而抗体则由阳极向阴极运动，二者在两孔之间接触，在琼脂凝胶中形成肉眼可见的灰白色沉淀线[3]。CEP法重复性好，与病理剖检结果的符合率达到100%；特异性强，达到97%；特异性高则敏感性低，敏感性仅75%，因此当水貂在感染ADV初期或转归期时由于抗体水平较低则可能出现假阴性结果，这也是每年在11月份左右只检疫1次而不能检测出所有阳性水貂的重要原因[4]。在AD的各种诊断方法中，CEP是世界公认的并且应用最为广泛的。但该法仍存在一些弊端，结果判定的误差较大，抗原多是细胞抗原或脏器抗原等全病毒抗原，存在着散毒的危险，耗时较长，需要特殊仪器设备和较高的技术支持，不适合于现场诊断。GICA是以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用原理，以胶体金为标记物来显示结果的一种新型的检测技术[5]。该方法操作简便、快捷，一般只要5～10min便可得到检测结果，且需要血量少，只需一滴血即可，减少了感染的机会。结果清楚、易于判断、误差小，不需要任何仪器、成本低廉，对操作人员技术要求不高，不受外界环境的影响等，非常适用于现场及自动化检测，缺点是由于采血后需要按标记顺序将采血纸粘贴在标记好的采血梳凹槽内，且检测试剂试纸条取出后应尽快使用，必须同时采血同时检测，增加现场工作劳动量。

本研究共检测水貂血清样品192个，采用GICA和CEP进行检测，结果GICA的阳性检出率为57.81%，CEP检出率为56.25%，二者符合率是98.44%。CEP检测阳性的GICA检测全部为阳性，CEP阴性、GICA阳性的为3只，不符合的数量为3只，而在检测中发现不符合的这3份血清T线显色条带相对较浅，推测可能是由于血清中AD抗体含量较低，而GICA敏感性比CEP相对较高，造成CEP未检出。徐磊等用PBS对AD阳性血清进行倍比稀释，用GICA分别进行检测，结果当血清稀释倍数至8倍时，仍能用GICA检测出，而传统的CEP法在血清稀释到4倍就不能检出，推测GICA的敏感性是CEP的至少2倍。他们同时用GICA和CEP分别检测了45只水貂，结果GICA阳性率为71.1%，CEP阳性率为62.2%，说明GICA法检出率较高，敏感性较好[6]。在检测成本方面，CEP法1只份抗原成本为2.00元，加上凝胶、缓冲液、阳性血清等每只的检测成本至少为2.50元，而GICA一只份成本也在2.50元左右，成本相当。

5　结论

胶体金免疫层析试纸条检测阿留申病有快速、简单、敏感性高、特异性强等优点，检测成本和对流免疫相当，还可进行现场检测，可以代替对流免疫电泳检测方法。

[1]闫喜军,肖家美,籍玉林.我国水貂阿留申病流行现状、特点及防治技术[J].特种经济动植物,2004,(05)：44.

[2]任二军,刘洁,刘进军,等.水貂阿留申病碘凝集与对流免疫电泳检测方法比较[J].经济动物学报,2017,(3)：134-136.

[3]Cho Hj Fau-Ingram D G,Ingram D G.Antigen and antibody in Aleutian disease in mink.II.The reaction of antibody with the Aleutian disease agent using immunodiffusion and immunoelectroosmophoresis[J].(0008-4050(Print)).

[4]于凯,倪佳,冯二凯,等.水貂阿留申病诊断抗原研究概述[J].动物医学进展,2017,(4)：116-119.

[5]庄金秋,梅建国,沈志强.胶体金免疫层析技术在兽医临床诊断中的应用进展[J].中国动物检疫,2012,(9)：70-75.

[6]徐磊.水貂阿留申胶体金免疫层析诊断方法的初步建立[D].City：中国农业科学院,2010.