喹乙醇对大肠杆菌抑菌效果的研究

李 迅,黄小燕

（上海亘泰实业集团，上海201015）

喹乙醇（Olaquindox），属喹恶啉类，又名喹酰胺醇，商品名倍育诺、快育灵等，由于大量研究发现喹乙醇具有的潜在毒性，大量或长期使用会引起较严重的中毒反应，另一方面，喹乙醇还可以通过食物链的富集作用危害人类身体健康 （王仁华等，2017）。因此，欧盟从1999年开始全面禁止使用喹乙醇。针对上述情况，本文为在低于35kg猪的生长过程中高效、合理利用低毒的抑菌药物喹乙醇提供理论依据。

1　材料

1.1　主要器材

滤纸片，试管，试管架，平皿，离心管，烧杯，1ml移液枪，5ml移液枪，锥形瓶，电子天平，高压灭菌锅，水浴锅，离心机，超净工作台，超声清洗器，恒温培养箱等。

1.2　供试菌种

大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌（salmonella）均由华南师范大学微生物实验室提供。

1.3　试剂

营养肉汤培养基，LB琼脂培养基，MH肉汤培养基，氯化钠，蒸馏水，喹乙醇粉末等。

2　方法

2.1　抑菌试验

2.1.1　试剂的配制

喹乙醇（100ppm）：市场上销售的喹乙醇粉剂中喹乙醇的含量是50%，配制纯的100ppm喹乙醇，就要每100ml水中加入喹乙醇粉剂20mg。

2.1.2　平板的制作

将LB琼脂培养基经高压蒸汽灭菌后，待冷却至 60℃左右，于超净工作台内分别倒入无菌培养皿中，每皿约 15ml，迅速盖好皿盖并轻轻晃动，保证培养基均匀铺于皿底，待冷却凝固。将活化后的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别密涂于LB琼脂培养基上。

2.1.3　纸片法

取直径 6mm的灭菌滤纸片放入制备好的喹乙醇药物中，充分浸泡2h。用无菌镊子夹取被喹乙醇泡过的滤纸片，分别贴于含菌平板上，每皿贴4片，中间空白对照贴无菌生理盐水泡过的滤纸片，每种菌重复三皿，将贴好药敏片的培养皿放于 36℃恒温培养箱中进行培养，细菌培养18～20h。取出观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，比较抑菌效果。重复试验3次，取各测量值的平均值。

2.2　最小抑菌浓度的测定

2.2.1　原理

医学上用来测试细菌对药物敏感性的一种方法，用此法来测定饲料添加剂的最小抑菌浓度，先将测试饲料添加剂作一系列倍比稀释，然后各试管加入适当稀释的试验菌液，摇匀，经培养后观察，以饲料添加剂最小抑菌浓度(MIC)管，即为试验菌株的敏感度。

2.2.2　实验步骤

2.2.2.1用LB琼脂培养基倒平板，制作含有固体培养基的无菌平皿，将保存在-20℃冰箱的大肠杆菌菌株划线接种到平皿中，37℃培养分离得到单菌落，再取单菌落划线接种到平皿中，得到单菌落，此步骤重复两次以上。

2.2.2.2在超净工作台中操作，将从步骤1中得到的单菌落接种到营养肉汤培养基中，得到菌悬液，37℃培养18h后，取菌悬液，用生理盐水稀释菌悬液，比对麦氏比浊管，使菌悬液中菌浓度近似值为0.5麦氏浓度，然后根据这个倍数，用MH肉汤培养基稀释菌悬液得到0.5麦氏浓度的菌液。

2.2.2.3制备1000ppm浓度的喹乙醇溶液：称取200mg含有50%喹乙醇浓度的粉末，溶解于已经灭菌了的100mlMH肉汤培养基中，在50℃～60℃的水浴锅中加热，促进溶解，然后用离心机离心得到澄清的含有1000ppm喹乙醇的MH肉汤培养基。

2.2.2.4在超净工作台中操作，取16支灭菌试管，编号1～16，1号试管加5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉汤培养基，2、3、4、……、13、14、16 号试管加 5ml灭菌了的 MH 肉汤培养基，第15号试管加5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉汤培养基作为对照。

2.2.2.5接着在步骤4后进行二倍稀释，第2号试管加入5ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉汤培养基，轻微摇晃混匀，得到第2号试管内喹乙醇浓度为500ppm，接着从第2号试管取出5ml液体到第3号试管内，轻微摇晃混匀，得到第3号试管内喹乙醇浓度为250ppm，……，依次逐管进行稀释到第14管，从14管取出5ml液体倒掉，从而得到第1～14号试管内喹乙醇浓度分别为：1000、500、250、125、64、32、16、8、4、2、1 和 0.5ppm。

2.2.2.6接种：向第1-14、16号试管内接种1ml的0.5麦氏浓度的菌悬液，第16号试管也作为对照组，第15号试管加1ml含有1000ppm喹乙醇的MH肉汤培养基，轻微摇晃混匀，用过滤膜封口试管，在37℃、150r/min的恒温培养箱中培养24h。

2.2.2.7观察并记录：24h后将试管取出，观察结果，以无菌生长的最低药液浓度作为喹乙醇的最小抑菌浓度，重复试验3次。

3　结果

图1　100ppm喹乙醇抑菌圈平板图

图2　1000ppm喹乙醇抑菌圈平板图

表1　喹乙醇（1000ppm）抑菌圈直径

3.1　抑菌实验结果

根据图1和图2观察发现，低浓度的喹乙醇没有表现出抑菌效果，而高浓度的喹乙醇有抑菌效果，且只对阴性菌有抑制作用，对阳性菌没有抑制作用；从表1和图2得出：1000ppm喹乙醇对沙门氏菌的效果要大于大肠杆菌。

3.2　最小抑菌浓度的测定

下图3中观察得到高浓度喹乙醇情况下试管内液体澄清，抑菌效果明显，低浓度喹乙醇情况下出现浑浊现象，浓度越低，浑浊现象越明显，从而抑菌作用也越来越小。对照组第15号试管澄清，另一对照组第16号试管出现浑浊现象。

图3　16支试管浑浊现象图

4　结论

本试验同时采用试管二倍稀释法联合纸片法对喹乙醇进行了体外抑菌作用研究，克服了以往试验的不足，既定性又定量地体现了喹乙醇的抑菌作用。实验结果显示喹乙醇对大肠杆菌和沙门氏菌有抑菌效果，印证了喹乙醇对大肠杆菌和沙门氏菌等阴性菌有较强的抑菌效果，但没有得出对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，这可能是需要更高的喹乙醇浓度才对金黄色葡萄球菌等阳性菌有抑菌效果。喹乙醇是一种可以使用的添加剂，但必须严格按照农业部的规定，限制用量及其饲喂对象，因此，规范喹乙醇的使用，在饲料当中精确的添加喹乙醇，既能促进猪的健康生长，又能抑杀致病菌，对于养猪业的健康发展具有重要的作用。

[1]宋春美,侯玉泽,刘宣兵,等.喹乙醇的危害及检测方法研究进展[J].河南农业科学,2009,38(12)：13-17.

[2]王仁华,练小华,谢益根.饲料中喹乙醇的应用效果研究[J].饲料与畜牧：新饲料,2017(2)：56-57.

[3]邬溪芮,张珍珍.喹乙醇的危害及其检测方法[J].兽医导刊,2017(9).