耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药现状及整合子耐药基因分析*

袁 利　徐羽中*　程明刚　刘香萍　李小永

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是院内获得性感染最为常见的一种条件致病菌，全球广泛流行，且感染率和耐药率呈逐步上升趋势，给临床抗感染治疗带来挑战[1-2]。PA可引起医院获得性肺炎、菌血症、尿路感染、伤口感染、继发性脑膜炎，亦可引起腹膜炎、心内膜炎及结膜炎等[3]。碳青霉烯类抗菌素是一类非典型的β-内酰胺类药物，因其抗菌谱广、对各种革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌和多数厌氧菌都具有强大的抗菌活性，且与头孢菌素类药物不存在交叉耐药性，对头孢菌素耐药的细菌仍有活性而成为临床上治疗PA感染最常用的抗菌素之一。但近年来，随着碳青霉烯类药物的广泛使用或滥用，导致耐碳青霉烯类PA菌大量产生，给临床抗感染治疗带来了新的挑战[4]。为此，本研究对深圳宝安区93株耐碳青霉烯类PA耐药现状及整合子耐药基因进行研究。

1　资料与方法

1.1　菌株来源

收集2015年10月至2017年5月深圳市宝安区人民医院临床分离的耐碳青霉烯类PA93株，其中痰液30株，血液27株，尿液13株，胸腔积液15株，分泌物8株，同一患者不同时期的标本仅纳入第1次采集的标本。

1.2　仪器与试剂

采用VITEK-2型全自动细菌生化鉴定和药敏分析仪和Vitek 2 compact系统(法国梅里埃公司)；StepOne实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分析仪(美国AB公司)。DNA marker、PCR扩增试剂盒(大连宝生物有限公司)；DNA Marker DL2000引物(上海Invitrogen公司合成)；16种抗菌药物均为英国OXOID公司产品；MH琼脂平板(广州市迪景微生物科技有限公司)；PowerPac Basic电泳仪和Laboratovies 6000凝胶成像系统(美国Bio－Rad公司)。

1.3　试验方法

1.3.1药敏试验

采用K-B法测定耐碳青霉烯类PA对16种抗菌药物的敏感性，以大肠埃希菌(ATCC25922)和PA(ATCC27853)作为药敏质控菌，结果判断参照美国临床和实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2011版标准进行。

1.3.2改良Hodge试验

采用直接菌落悬液法制备大肠埃希菌ATCC25922 0.5麦氏浊度菌悬液，用8.5 g/L氯化钠溶液按1∶10比例进行稀释，然后涂在MH琼脂平板上，干燥3～10 min后在中央贴美洛培南纸片。用无菌拭子挑3个待测菌菌落或者质控菌悬液，从纸片边缘到平板边缘划直线的方式接种，37 ℃培养20 h。与大肠埃希菌抑菌环交接产生向抑菌圈内增强生长现象为产碳青霉烯酶阳性菌株。

1.3.3超广谱β-内酰胺酶检测

将待测菌制成0.5麦氏浊度，均匀涂在MH平板上，干燥3～10 min，贴头孢他啶和(或)克拉维酸、头孢他啶、头孢噻肟和(或)克拉维酸等药敏片，于37 ℃孵育18 h。任一复合纸片抑菌环直径与单一纸片抑菌环直径相比≥5 mm，则为产超广谱β-内酰胺酶。

1.3.4整合子耐药基因检测

(1)细菌DNA提取。挑取单个菌落于1.5 ml生理盐水中，35 ℃孵育过夜，12000 rpm，离心5 min后去上清液，使用细菌DNA提取试剂盒进行基因组DNA小量纯化，操作严格按试剂盒说明书进行。PCR反应体系为50 μl，其中Premix Taq 25 μl，DNA模板3 μl，20 μmol/L的引物2 μl，灭菌蒸馏水20 μl。

(2)扩增条件。94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→55 ℃30 s→72 ℃1 min→30个循环后→72 ℃ 10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶，在5 V/cm环境下电泳30 min，后用Laboratovies 6000凝胶成像系统分析结果。

1.4　统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，计数资料以率(%)表示，组间比较采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　药敏结果

在93株耐碳青霉烯类PA中，对16种抗菌素药物耐药率＜60%以上的占43.75%，其中最高的为复方新诺明和氨苄西林和(或)舒巴坦，耐药率分别为97.0%和95.0%，其次为替卡西林和甲氧苄啶和(或)磺胺甲恶唑，耐药率分别为85.0%和82.0%，耐药率最低的为多粘菌素E，为11.0%，其次为亚胺培南和美洛培南，耐药率分别为20.0%和23.0%，见表1。

表1　93株PA对16种抗菌素的耐药率(%)

2.2　PA碳青霉烯酶及β-内酰胺酶检测结果

改良Hodge法检测93株PA中的碳青霉烯酶阳性菌株75株，阳性率为80.7%，β-内酰胺酶阳性菌株53株，阳性率为57.0%。改良Hodge法与PCR比较，检测碳青霉烯酶存在假阳性和假阴性，但差异均无统计学意义，见表2。

表2　改良Hodgo法与PCR检测碳青霉烯酶结果比较[株]

2.3　PA整合子耐药基因检测结果

在93株PA整合子耐药基因检测中，阳性率最高的为blaSHV-11基因(占81.7%)，其次为blaKPC-2基因(占63.4%)；基因阳性率最低的为blaSHV-142和blaIMP-4基因，分别为2.2%和4.3%；3株同时检出blaKPC-2和blaTEM-1基因，1株同时检出blaCTM-M-14基因和blaCTM-M-65基因，78株同时检出3种及以上耐药基因，见表3，如图1所示。

表3　93株PA整合子耐药基因阳性率

图1　部分耐药基因凝胶电泳图

3　讨论

PA是院内获得性感染最为常见的一种条件致病菌，属非发酵革兰阴性杆菌，常导致皮肤软组织、呼吸道、泌尿道、生殖道及院内等感染，呈全球性流行。有关研究结果显示，PA感染率为10.3%，仅次于大肠埃希菌，居第2位[5]。近年来，随着碳青霉烯类抗菌素的广泛应用及侵入性诊疗手段的普及，PA感染率及耐药率呈逐年上升趋势，已成为院内感染主要病原菌，甚至对碳青霉烯类抗菌素产生了多重性耐药，给临床抗感染治疗和控制院内感染带来了极大的挑战[6-7]。因此，不同地区对耐碳青霉烯类PA的耐药性和整合子耐药基因进行研究，分析其耐药机制，对指导临床科学用药和控制院内感染具有重大的临床意义[8-9]。

碳青霉烯类抗菌素是由改变青霉素结构而研发的一类β-内酰胺类药，杀菌机理主要通过抑制细菌细胞壁合成粘肽酶，即青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)的合成，进而阻止细胞壁粘肽的合成导致细菌细胞壁缺损、通透性增加、菌体膨胀、胞浆渗透压改变和细菌溶解等途径杀灭细菌。同时，碳青霉烯类抗菌素杀菌作用具有选择性，对宿主细胞毒性小而广泛应用于临床抗感染治疗。

碳青霉烯类抗菌素因抗菌谱广和抗菌活性强、杀菌效率快、能减少细菌内毒素的释放、对β-内酰胺酶[如头孢菌素酶(cephalosporin enzyme，AmpC)具有高度的稳定性、对肠杆菌科细菌具有高度的敏感性、疗效肯定及能血液透析清除[10-11]等优点而广泛用于临床抗感染治疗，是治疗PA感染首选药物。但近年来，随着碳青霉烯类抗菌素广泛使用和滥用，耐药菌逐渐出现并可见多重耐药菌株，对第3代、4代头孢和亚胺培南在内的多种β内酰胺类及氨基糖苷类抗菌素产生了耐药，且呈逐年上升的趋势[9-12]。本研究结果显示，深圳宝安地区93株耐碳青霉烯类PA对16种抗菌素耐药率与国内外有关文献报导相一致，表明本地区PA对碳青霉烯类抗菌素耐药情况非常严重，应引起当地医疗机构高度重视。

β-内酰胺酶阳性可引起PA对青霉素类、头孢菌素类等β-内酰胺酶类药耐药，而碳青霉烯酶阳性可引起PA对碳青霉烯类药耐药。本研究结果显示，深圳宝安地区93株PA碳青霉烯酶阳性率达到80.7%，超广谱β-内酰胺酶阳性率为57.0%，表明了碳青霉烯酶阳性和(或)超广谱β-内酰胺酶阳性是导致本地区PA对碳青霉烯类抗生素产生耐药的主要原因之一。

整合子是PA对碳青霉烯类抗菌素产生耐药的一个新的耐药基因传播元件，由5保守区、3保守区及两者之间的可变区构成，整合子对PA的耐药和多重耐药的形成起着重要作用[16-18]。其中，blaSHV基因是编码β-内酰胺酶的基因，可引起PA对青霉素类、头孢菌素类等β-内酰胺酶类药耐药；blaVIM和blaIMP基因是编码碳青霉烯酶的基因，可引起PA对碳青霉烯类药耐药；aadA是编码氨基糖腺苷转移酶的基因及aadB是编码氨基糖苷类乙酰基转移酶的基因，可引起PA对庆大霉素、妥布霉素的耐药。本研究结果显示，深圳宝安区93株PA整合子耐药基因阳性率最高的为blaSHV-11和blaKPC-2基因，阳性率最低的为blaSHV-142和blaIMP-4基因；3株同时检出blaKPC-2和blaTEM-1基因，1株同时检出blaCTM-M-14和blaCTM-M-65基因，78株同时检出3种及以上耐药基因，表明了PA产生整合子耐药基因也是本地区PA对碳青霉烯类抗菌素产生耐药的重要原因之一。

深圳宝安地区PA对碳青霉烯类抗菌素耐药情况比较严重，耐药机制复杂，同一地区流行的耐药菌株具有相似的基因型及耐药基因。因此，不同地区应进行耐碳青霉烯类PA耐药情况和耐药基因检测，根据药敏结果以及感染部位的血药浓度等合适选择抗菌素规范化使用，减少耐药菌株的产生[19]。

[1]Taneja N，Singh G，Singh M，et a1.Emergence of tigecycline colistin resistant Aeinetobacter baumanii in patients with eomplicared urinary tract infections in north Indial[J].Indian J Med Res，2011，133(6)：681-684.

[2]唐慧琴，陈定强，吴爱武.亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的耐药性与相关耐药基因[J].实用医学杂志，2016，32(23)：3947-3950.

[3]冯霞，林红燕，杨俊，等.铜绿假单抱菌耐药性与广谱杭菌药物消耗量相关性研究[J].中国医院用药评价与分析，2006，6(3)：159-161.

[4]Papp-Wallance KM，Endimiani A，Taracila MA，et al.Carbapenems：past，present，and fufure[J].Antimicrob Agents Chem Other，2011，55(11)：4943-4960.

[5]马越，李景云，张新妹，等.2002年临床常见细菌耐药性监测[J].中华检验医学杂志，2004，27(1)：38-45.

[6]Ion-Nedelcu N，Lambru K，Lumini AR，et a1.Risk of hospital death in nosoeomial infection with multi-drug resistant A.baumanii or P.aemginosa.Baeteriol Vimsol Parazitol Epid emiol[J].2010，55(1)：29-33.

[7]Dai NDZ，Chen JC，Chen YS，et a1.Drugresistant genes carried by Acinetobaeter baumanii isolated from patients with lower mspimtou tract infection[J].Chin Med J(En)，2010，123(18)：2571-2575.

[8]朱葵向，金妙玲.多重耐药铜绿假单胞茵的耐药基因分析[J].现代实用医学，2016，28(2)：215-216.

[9]Zavascki AP，Carvalhaes CG，Picao RC，et al.Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa and acinetobacter baumannii：resistance mechanisms and implications for therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2010，8(1)：71-93.

[10]帕尼培南-倍他米隆临床研究小组.帕尼培南-倍他米隆治疗665例中重度肺部感染疗效与安全性[J].中华内科杂志，2012，51(7)：547-550.

[11]陆人杰，唐风雷，王燕龙，等.碳青霉烯类抗生素多立培南的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2013，32(5)：346-351.

[12]高国香，韩璐.绿脓假单胞菌的检出状况及耐药性分析[J].中国社区医师，2009，12(9)：79-80.

[13]王福海.青霉烯类抗生素药理学研究进展[J].中国医药指南，2011，7(9)：236-237.

[14]王辉，陈民钧.1994-2001年中国重症监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁[J].中华医学杂志，2003，83(5)：385-390.

[15]段建春，吕晓菊.革兰氏阴性菌对氨基糖苷类抗生素耐药机制的研究进展[J].中国抗生素杂志，2004，29(6)：329-331.

[16]Fluit AC，Schmitz FJ.Resistance integrons and superintegrons[J].Clin Microbiol Infect，2004，10(4)：272-288.

[17]Quinteira S，Sousa JC，Peixe L.Characterization of In100，a new integron carrying a metallo-βlactamase and a carbenicillinase，from pseudomona aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chem Other，2005，49(1)：451-453.

[18]肖晓光，李艳莲，孙国华.铜绿假单胞菌整合子系统与多重耐药关系的探讨[J].中国实验诊断学，2016，20(6)：966-969.

[19]司忠花，董玉俊，李玉.基层医院铜绿假单胞菌耐药性分析及耐药基因检测[J].中华医院感染学杂志，2017，27(1)：43-46.