响应面法优化紫果西番莲果胶多糖脱色工艺

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(1.华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510006; 2.广州军区广州总医院药学部,广东广州 510010; 3.广州中医药大学,广东广州 510405)

紫果西番莲(PassifloraedulisSims)多为草本或木质藤本多年生植物,《云南中药资源名录》中有收载,其根、藤、花、果可入药,具有活血止痛、清热止咳等功效[1]。西番莲果皮占整果质量的45%～55%[2],若对果皮资源进行有效利用,将极大减少资源的浪费。果胶多糖是一种高价值的功能性食品添加剂,常被用作凝胶剂和稳定剂。研究发现果胶多糖在抗癌、重金属吸附等方面有明显作用[3]。

果胶多糖色泽深、杂质多,不利于作为功能性产品的进一步开发与利用,通常需进行脱色处理。目前常用多糖脱色的方法有活性炭吸附、双氧水法、树脂法等[4]。张丰进等[5]研究发现紫果西番莲果皮色素主要是阴离子型分子,活性炭吸附脱色效果远低于树脂法,不宜进行果胶多糖脱色处理。双氧水法是工业化生产中常用方法,虽然其脱色效果良好,但易造成多糖的氧化损失。树脂因具有吸附力较高、结构破坏力小、可重复利用的特点而被广泛使用。本研究通过静态吸附法从六种树脂中筛选出对果胶多糖最佳脱色效果的聚酰胺树脂,以进样量、流速及pH为自变量,以半乳糖醛酸保留率和脱色率为响应值,运用响应面分析法,对该树脂的脱色工艺条件进行优化。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

紫果西番莲果皮广东省梅州市五华县;D301R阴离子交换树脂、AB-8、NKA-9、X-5大孔吸附树脂、001×7阳离子交换树脂、聚酰胺树脂广州市齐云生物科技有限公司;半乳糖醛酸标准品Sigma公司;考马斯亮蓝G250国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白HyClone公司;浓硫酸、磷酸、氢氧化钠、盐酸分析纯。

ZHWY-200B恒温摇床上海智城分析仪器制造有限公司;PHS-3D型pH计上海精密科学仪器有限公司;YPJ-337紫外可见光分光光度计北京莱伯泰仪器有限公司;BP210S型分析天平sartorius公司;HH-2恒温水浴锅金坛市富华仪器有限公司;1.5 cm×30 cm层析柱上海达丰玻璃仪器厂。

1.2　实验方法

1.2.1紫果西番莲果胶多糖的制备参照陈颖珊等[6]采用混合酸法提取果胶多糖,以30%柠檬酸盐酸混合溶液(30%柠檬酸∶盐酸=1∶2,V/V),料液比1∶45 (w/v),65 ℃条件下提取3次,每次1 h。定性滤纸抽滤,合并滤液,即得果胶多糖提取液,备用。

1.2.2脱色率测定取1 mL果胶多糖液,用5 mL蒸馏水稀释,混匀后分别于380、400、450 nm处测定,取平均吸光度值A,脱色率计算公式为:脱色率(%)=(A脱色前-A脱色后)/A脱色前×100

1.2.3半乳糖醛酸保留率的测定标准曲线的制作参考陈颖珊等[6]的方法。在528 nm波长下测定吸光度,以半乳糖醛酸含量横坐标,以吸光度值纵坐标,绘制标准曲线得回归方程y=0.0049x-0.0054,R2=0.9991。

采用咔唑比色法[7]测定多糖溶液脱色前后半乳糖醛酸含量,于525 nm处测定吸光度A值,保留率计算式为:半乳糖醛酸保留率(%)=A脱色后/A脱色前×100

1.2.4蛋白质脱除率的测定标准曲线:取6支试管,编号1、2、3、4、5、6,分别依次加入0、20、40、60、80、100 μg/mL牛血清白蛋白溶液,蒸馏水补足至1 mL,各加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液,充分混匀,静置2 min后于595 nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标,以牛血清白蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程y=0.0072x+0.0069,R2=0.9983。

采用考马斯亮蓝法[8]测定多糖溶液脱色前后蛋白质含量,于595 nm处测定吸光度A值,脱除率计算公式为:蛋白质脱除率(%)=(A脱色前-A脱色后)/A脱色前×100

1.2.5树脂的预处理大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h,并以无水乙醇洗脱至无色,蒸馏水洗至无醇味。阳离子树脂采用蒸馏水浸泡24 h,蒸馏水洗至澄清,过滤后用1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h,蒸馏水洗至中性,过滤,用1 mol/L HCl溶液浸泡24 h,蒸馏水洗至中性。聚酰胺树脂用90%～95%乙醇浸泡1 h,装柱。继续用乙醇洗脱至洗脱液透明,次用2～2.5倍体积的5% NaOH、1倍的体积蒸馏水、2～2.5倍体积10%醋酸水溶液洗脱,最后用蒸馏水洗至pH中性。

1.2.6静态吸附实验D301R、AB-8、NKA-9、X-5、001×7、聚酰胺共六种树脂预处理后,分别各称取2 g放入100 mL具塞锥形瓶中,分别加入60 mL备好的5 mg/mL果胶多糖提取液,室温下100 r/min,恒温振荡0.5、1、1.5、2、3、4 h后取上清液2 mL,计算其脱色率、半乳糖醛酸保留率以及蛋白脱除率,以确定最佳树脂用于动态吸附实验。

1.2.7聚酰胺树脂动态吸附单因素实验

1.2.7.1进样量对脱色率、半乳糖醛酸保留率影响树脂装柱12 cm(BV=21 mL),装柱平衡后,调节果胶多糖液pH3.0,分别以1、2、3、4、5 BV进样,迅速调节流速3 BV/h,然后用0.25 BV蒸馏水冲洗。过柱液与洗液合并,检测脱色率及半乳糖醛酸保留率。

1.2.7.2流速对脱色率、半乳糖醛酸保留率影响树脂装柱12 cm,装柱平衡后,调节果胶多糖液pH3.0,以4 BV进样,迅速调节流速1、2、3、6、9 BV/h,然后用0.25 BV蒸馏水冲洗。过柱液与洗液合并,检测脱色率及半乳糖醛酸保留率。

1.2.7.3pH对脱色率、半乳糖醛酸保留率影响树脂装柱12 cm,装柱平衡后,调节果胶多糖液pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,以4 BV进样,迅速调节流速3 BV/h,然后用0.25 BV蒸馏水冲洗。过柱液与洗液合并,检测脱色率及半乳糖醛酸保留率。

1.2.8聚酰胺树脂脱色工艺响应面优化以Box-Benhnken设计原理为根据,以上样量、体积流速、pH为自变量,以半乳糖醛酸保留率和脱色率为响应值,设计三因素三水平响应面分析方法,因素水平见表1。

表1　脱色工艺响应面因素水平表Table 1　Factors and levels of response surface for decolorization technology

表2　六种不同型号树脂脱色率、半乳糖醛酸保留率、蛋白质脱除率结果Table 2　Results on decolorization rate,galacturonic acid retention rate,deproteinization rate by six different resins

2　结果与分析

2.1　静态吸附实验

有研究表明聚酰胺树脂是由酰胺聚合而成的高分子聚合物,通过氢键吸附溶液中的阴离子,如酚类、黄酮类化合物的酚羟基,或醌类、脂肪羧酸的羰基[9]。通过静态吸附模型,分别以脱色率、半乳糖醛酸保留率、蛋白质脱除率为考察指标,六种不同型号树脂结果见表2,聚酰胺脱色效果最佳,选择其进行进一步的脱色工艺优化。

2.2　聚酰胺树脂动态吸附单因素实验

2.2.1进样量对脱色率和半乳糖醛酸保留率的影响以半乳糖醛酸保留率和脱色率为指标,考察聚酰胺树脂有效色素吸附量,以确定最佳进样量。图1表明,当进样量由1 BV增大到5 BV时,半乳糖醛酸保留率逐渐增加,而脱色率则逐渐减少。在进样量为4 BV时,半乳糖醛酸保留率超过80%以上,呈趋于饱和状态,脱色率也保持50%以上,而4 BV过后脱色率则快速下降,说明4 BV为聚酰胺动态吸附最佳进样量。同时也表明进样量4BV时色素吸附量以达到饱和。

图1　进样量对脱色率和半乳糖醛酸保留率的影响Fig.1　Effect of injection volume on decolorization rate and galacturonic acid retention rate

2.2.2流速对脱色率和半乳糖醛酸保留率的影响由图2可知,当流速由1 BV/h增大至9 BV/h时,半乳糖醛酸保留率先缓慢增大后缓慢减少,脱色率则先减少后缓慢增大,说明聚酰胺树脂对多糖出现反复吸附和解吸过程。在流速为6 BV/h时有接近85%半乳糖醛酸保留率,但其脱色率低于50%,说明流速过快可能导致色素分子未能与树脂结合;而在流速为3 BV/h时,半乳糖醛酸保留率为84%,且脱色率超过50%,脱色效果显著增强,因此3 BV/h为最佳流速。

图2　流速对脱色率和半乳糖醛酸保留率的影响Fig.2　Effect of flow rates on decolorization rate and galacturonic acid retention rate

2.2.3pH对脱色率和半乳糖醛酸保留率的影响由图3可知,随着糖液pH从2.0增大到6.0,半乳糖醛酸保留率先逐渐增加后快速减少,而脱色率变化不明显。当pH为4.0时,半乳糖醛酸保留率为85%,脱色率超过50%,此时的pH为最佳选择。

图3　pH对脱色率和半乳糖醛酸保留率的影响Fig.3　Effect of pH on decolorization rate and galacturonic acid retention rate

2.3　聚酰胺树脂脱色工艺响应面优化

通过响应面分析法优化聚酰胺树脂动态吸附进样量、流速和pH最佳参数,以获得高脱色率和高半乳糖醛酸保留率的脱色工艺。根据Box-Behnken设计和RSA程序对17组响应值作多元回归拟合及方差分析见表3。

注：p<0.05显著,用*表示;p<0.01极显著,用**表示;表5同。

表3　聚酰胺树脂脱色工艺响应面分析与结果Table 3　Response surface analysis and results of polyamide resin decolorization technology

2.3.1响应值为脱色率的回归拟合与响应面分析由表4可知,模型极显著(p<0.01);失拟项p=0.4309>0.05不显著,说明模型可靠;R2为0.9787说明脱色率有97.87%的变化来自所选自变量,该模型拟合度良好;信噪比大于4说明该模型信号很强。综上所述,该实验方法模拟真实实验可行。方程中A、B、C均为极显著性因素,说明各因素对脱色率的影响不是简单线性关系。三个因素对多糖脱色率影响的顺序依次是:进样量(A)>流速(B)>pH(C)。进样量(A)、流速(B)、pH(C)这三个因素与脱色率之间的二次多项回归方程为:脱色率(%)=51.6-3.26A-1.84B-0.79C-0.35AB+0.53 AC+0.49BC-0.50A2-0.65B2-0.28C2。

图4～图6是根据回归分析结果作出的响应面图,可直观反映各因素间交互作用对响应值的影响。由图4和5可看出,不同流速和进样量、pH和进样量分别对曲线最高点影响较小,说明两因素无显著交互作用。图5曲面比图4弯曲,说明两者的交互作用比流速和进样量间的大,而图6曲面较陡,表明pH和流速交互作用相对明显,方差分析佐证交互关系不显著。因此,进样量、流速、pH三因素之间无显著的相互作用。

图4　流速和进样量对脱色率的影响 Fig.4　Effect of injection volume and flow rate on decolorization rate

图5　pH和进样量对脱色率的影响Fig.5　Effect of pH and injection volume on decolorization rate

表5　半乳糖醛酸保留率为响应值方差分析表Table 5　Variance analysis of response value for galacturonic acid retention rate

图6　pH和流速对脱色率的影响Fig.6　Effect of pH and flow rate on decolorization rate

2.3.2以半乳糖醛酸保留率为响应值的回归拟合与响应面分析由表5可知,方差分析表明模型极显著(p<0.01),失拟项不显著(p=0.8968>0.05),说明模型可靠;R2为0.9688说明半乳糖醛酸保留率有96.88%的变化来自所选自变量;信噪比>4说明该模型信号很强,综上所述,该模型可真实地模拟实际实验情况。结果表明,A、B、C、AC均为极显著性因素,C2为显著性因素,说明各因素对半乳糖醛酸保留率的影响不是简单线性关系。各因素对半乳糖醛酸保留率的影响依次为:进样量(A)>流速(B)>pH(C)。进样量(A)、流速(B)、pH(C)这三个因素与半乳糖醛酸保留率的二次多项回归方程为:Y(%)=88.86+2.87A+2.19B-1.87C-0.39AB+1.67AC+0.66BC-0.48A2-0.39B2-1.18C2。

由图7可以看出,曲面平滑,表明流速和进样量两个因素不存在明显的交互作用。图8中曲面陡峭,进样量对pH曲线最高点影响小,而pH对进样量曲线最高点影响较大,说明两者的交互作用较大。图9中pH和流速之间的交互作用比图7大,曲面较陡,但不显著。综上所述,三者间仅有pH和进样量间存在交互作用,表明改变pH需适当调整进样量才可获得理想半乳糖醛酸保留率。

图7　流速与进样量对半乳糖醛酸保留率的影响Fig.7　Effect of flow rate and injection volume on galacturonic acid retention rate

图8　pH与进样量对半乳糖醛酸保留率的影响Fig.8　Effect of pH and injection volume on galacturonic acid retention rate

图9　pH与流速对半乳糖醛酸保留率的影响Fig.9　Effect of pH and flow rate on galacturonic acid retention rate

2.4　验证实验

称取西番莲果皮5份,每次15.0 g,按照进样量3.5 BV,流速3 BV/h,pH3.5的脱色工艺条件进行验证,此时脱色率预期值为53.41%,半乳糖醛酸保留率预期值为87.2%。5次实验得平均果胶多糖脱色率为52.78%,实际值达理论预测值的98.82%;得半乳糖醛酸保留率为85.62%,实际值达理论预侧值的98.19%,说明该优化方法可行。

3　结论

通过静态吸附实验,发现聚酰胺树脂具有良好的脱色率、半乳糖醛酸保留率及蛋白质脱除率,分别为49.69%、87.56%、71.53%。本研究中表明聚酰胺树脂的脱色效果优于D301R阴离子树脂、001×7阳离子树脂和X-5、AB-8、NKA-9三种大孔吸附树脂,说明多糖提取液中的色素分子结构可能与黄酮、酚类化相似。综合回归模型分析和验证实验,最终确定聚酰胺树脂对紫果西番莲果胶多糖的最佳脱色工艺参数为:进样量3.5 BV,流速3 BV/h,pH3.5,在此条件下,半乳糖醛酸保留率为85.62%,脱色率为52.78%,分别达理论预测值的98.82%和98.19%,验证了数学模型的有效性,具有一定的实际生产意义。

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