响应面法优化东北红松针总黄酮的超声辅助乙醇提取工艺

2018-04-13,,,,

食品工业科技 2018年4期

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(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076)

红松(PinuskoraiensisSieb.etZucc.)主要分布于俄罗斯远东南部、朝鲜半岛、日本本州及中国东北部地区,分布数量以中国为首,主要集中于长白山,小兴安岭一带,属于天然可再生资源[1]。松针是松树的针形叶子,松属植物的副产物之一,含有丰富的黄酮、挥发油、色素、维生素、粗蛋白、萜类等多种成分。具有止咳镇痛,疏风活血,明目安神,提高免疫力,降三高等作用[2-3]。关于松针国内外研究,主要对松针化学成分进行分析[4],其黄酮物质具有抗氧化和抗肿瘤作用[5],松针提取物可以减轻大鼠胰岛素抵抗力[6]。提取物中精油可以提高小鼠记忆力,且具有抑菌作用[7-8]。针叶被广泛运用在茶饮及乳制品等的制作中[9-10]。高岩等[12]采用乙醇溶液回流法从红松针中提取黄酮类物质;站英等[13]采用微波辅助乙醇法确定了红松针总黄酮提取的最佳工艺;文攀等[14]利用超声波辅助提取红松籽壳中的总黄酮。以往研究中对东北红松针黄酮研究较少,本实验主要针对东北丰富的红松资源并结合超声波空穴作用,以优化超声波辅助乙醇提取总黄酮工艺条件为目的,探索东北红松针总黄酮的含量,为大批量合理开发利用东北松针资源提供可行性理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

红松松针新鲜松针预处理除杂,室温下阴干,粉碎后过60目筛储存在广口瓶中备用,黑龙江省小兴安岭;芦丁标准品(纯度98%)中国食品药品鉴定研究院;无水乙醇(分析纯)、亚硝酸钠(分析纯)、硝酸铝(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)天津市天力化学试剂有限公司。

DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司;DEF-500型摇摆式高速万能粉碎机温岭市林大机械有限公司;HC-7P11-5 型架盘药物天平上海精科科技有限公司;FA2004B型电子天平上海越平科学仪器有限公司;KQ-500VDED双频数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;TDL-4A 离心机上海菲恰尔分析仪器有限公司;V5000型可见分光光度计上海元析仪器有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1工艺流程新鲜红松松针除杂阴干→粉碎过筛(60目筛)→称取松针粉末→乙醇溶解→超声辅助提取→离心(4000 r/min)→上清液定容→NaNO2-Al(NO3)3显色法显色(参照文献[15])→测定吸光度→计算总黄酮得率。

1.2.2标准曲线的绘制配制浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液,硝酸铝显色法[16]制作芦丁标准曲线,分析处理可得到线性回归方程。

1.2.3总黄酮得率的计算取在不同条件下所得的样品滤液稀释到一定体积,并取稀释液1.0 mL于10 mL比色管中,显色反应后,测定其吸光度,结合公式(1)和标准曲线回归方程,求出松针总黄酮的得率[17]。

式(1)

式中:Y-松针总黄酮得率,%;C-松针总黄铜质量浓度,mg/mL;N-稀释的倍数;m-称取松针粉末的质量,g;V-提取液体积,mL。

1.2.4单因素实验实验以松针总黄铜得率为评价指标,选取工艺中的料液比、超声时间、超声温度和乙醇的体积分数为影响因素确定其提取的最适范围,平行实验三次,计算得率。单因素实验设计如下:

1.2.4.1不同料液比对松针总黄酮得率的影响准确称取1.00 g过60目筛备用的红松松针粉末若干份于250 mL碘量瓶中,设置料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL,乙醇的体积分数为50%,超声温度为65 ℃,功率为500 W的条件下,超声100 min后4000 r/min离心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中显色测定其吸光度。平行实验三次取平均值,按公式(1)计算总黄酮得率。

1.2.4.2不同的乙醇体积分数对松针总黄酮得率的影响准确称取1.00 g过60目筛备用的红松松针粉末若干份于250 mL碘量瓶中,设置乙醇体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比为1∶50 g/mL,超声温度为65 ℃,功率为500 W的条件下超声100 min后4000 r/min离心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中显色测定其吸光度。平行实验三次取平均值,按公式(1)计算总黄酮得率。

1.2.4.3不同超声温度对松针总黄酮得率的影响准确称取1.00 g过60目筛备用的红松松针粉末若干份于250 mL碘量瓶中,设置超声温度为40、50、60、70、80、90 ℃下,料液比为1∶50 g/mL,功率为500 W的条件下,超声100 min后,同样4000 r/min离心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中显色测定其吸光度。平行实验三次取平均值,按公式(1)计算总黄酮得率。

1.2.4.4不同超声时间对松针总黄酮得率的影响准确称取1.00 g过60目筛备用的红松松针粉末若干份于250 mL碘量瓶中,加入50 mL体积分数为50%的乙醇溶液,料液比为1∶50 g/mL,超声温度为65 ℃,500 W下分别超声20、40、60、80、100、120、140、160、180 min后,4000 r/min离心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中显色测定其吸光度。平行实验三次取平均值,按公式(1)计算总黄酮得率。

1.2.5Box-Behnken响应面实验优化提取条件在单因素实验的基础上,根据响应面设计原理[18],选取料液比、乙醇体积分数、超声温度和超声时间为影响因素[19]。设计四因素三水平响应面优化实验,进一步优化分析,确定超声波辅助乙醇提取红松松针总黄酮的最佳条件[20]。设计因素水平表见表1。

表1　响应曲面因素水平表Table 1　Analytical factors and levels of response surface methodology

1.3　数据处理

实验操作重复三次取平均值,计算标准误差并制图分析。根据Design-Expert 8.05软件,设计响应面实验方案、建立数学模型并进行多元回归分析,选择最佳提取工艺参数。

2　结果与分析

2.1　标准曲线的绘制

可见分光光度计510 nm处测定不同浓度梯度的芦丁标准品溶液的吸光值,以芦丁标准品的浓度作为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线[21]。如图1所示,可以得到方程y=11.75x+0.0006,R2=0.9971。

图1　芦丁标准曲线Fig.1　The standard curve of rutin

2.2　单因素实验结果与分析

2.2.1料液比对红松松针总黄酮得率的影响根据图2可知,当料液比在1∶10～1∶50 g/mL之间,增大料液比,总黄酮得率随之升高。当料液比为1∶50 g/mL时,得率最高,而当料液比超过1∶50 g/mL时,得率开始下降,黄酮的溶解已达到了饱和,其他非黄酮类成分随着溶出,影响总黄酮得率。根据总黄酮得率,可以确定料液比为1∶50 g/mL时为最适料液比。

图2　料液比对松针中总黄酮得率的影响Fig.2　Effect of ratio of material to liquid on the yield of total flavonoid from pine needle

2.2.2乙醇体积分数对红松松针总黄酮得率的影响根据图3可知,当乙醇体积分数小于50%时，随着乙醇体积分数的增大,总黄酮得率也随之升高,当乙醇体积分数达到50%时总黄酮得率最高,乙醇体积分数大于50%之后,得率却随之下降。乙醇浓度的大小影响着极性的大小,当浓度为50%时,与松针总黄酮的极性相似,溶解率达到了最大,而乙醇的体积浓度过大时,醇溶性杂质也会随着溶出,影响总黄酮得率[22]。因此确定最适乙醇体积浓度为50%。

图3　乙醇的体积分数对松针中总黄酮得率的影响Fig.3　Effects of ethanol concentration on the yield of total flavonoid from pine needle

2.2.3超声温度对红松松针总黄酮得率的影响根据图4可知,当温度在40～70 ℃之间,温度升高,总黄酮得率也随之升高,在一定温度下,物质的溶解量是一定的,温度升高,加快了分子的运动速度,总黄酮溶解渗透能力升高,当温度大于70 ℃,总黄酮得率下降,过高的温度导致部分黄酮内部结构破损,失去活性,得率降低[23],因此超声最适温度为70 ℃。

图4　超声温度对松针中总黄酮得率的影响Fig.4　Effects of ultrasonic temperature on the yield of flavonoid from pine needle

2.2.4超声时间对红松松针总黄酮得率的影响由图5可知,当超声时间从20 min增长到100 min时,随着时间的增加,总黄酮得率也随之升高,开始提取时,总黄酮物质与乙醇溶液之间存在浓度差,增长提取时间,黄酮类物质充分溶出,浓度差减小,当超声时间为100 min时,总黄酮溶解度饱和,得率达到了最高。之后随时间增加,提取率反而下降,可能的原因是超声波的空穴作用过度,使细胞结构破损,胞内非黄酮物质随之溶出,使得率下降[24],因此确定提取的最佳时间为100 min。

图5　超声时间对松针中总黄酮得率的影响Fig.5　Effects of ultrasonic time on the yield of total flavonoid from pine needle

2.3　响应面实验结果与分析

2.3.1模型组合设计及方差分析应用Box-Behnken中心组合实验设计原理,选择A料液比、B乙醇体积分数、C超声温度、D超声时间为影响主要因素,以东北红松松针Y总黄酮得率为响应值[25],得出的实验结果见表2,超声波辅助乙醇提取东北红松松针总黄酮得率数据模型方差分析表见表3。

表2　响应面分析设计及结果Table 2　Design and results of response surface analysis

表3　响应曲面方差分析表Table 3　Analysis of response surface variance table

注：*：p<0.05表示差异显著;**：p<0.01表示差异较显著;***：p<0.001表示差异极显著。

利用Design-Expert软件对表2的数据,进行多元回归拟合,二次回归方程为:Y(%)=5.79+0.037A+0.039B+0.33C+0.050D+0.057AB+0.12AC+0.060AD+0.17BC-0.060BD+0.24CD-0.53A2-0.82B2-0.31C2-0.71D2。

图6　乙醇的体积分数与料液比响应面及等高线图Fig.6　Response surface and contour plots of ethanol concentration and material to liquid ratio

图7　超声温度与料液比响应面及等高线图Fig.7　Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and material to liquid ratio

图8　超声时间与料液比响应面及等高线图Fig.8　Response surface and contour plots of ultrasonic time and material to liquid ratio

图9　超声温度与乙醇体积分数响应面及等高线图Fig.9　Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and ethanol concentration

图10　超声时间与乙醇体积分数响应面及等高线图Fig.10　Response surface and contour plots of ultrasonic time and ethanol concentration

图11　超声时间与超声温度响应面及等高线图Fig.11　Response surface and contour plots of ultrasonic time and ultrasonic temperature

2.3.2响应面分析根据Box-Behnken分析得到各因素交互作用对松针总黄酮得率的影响。由等高线图可知等高线中心位置向边缘延伸,总黄酮得率逐渐减少,中心位置表示得率最高。另一方面,三维曲面的陡峭程度反应出响应值随着实验条件的改变而改变,曲面越陡峭,实验条件改变对总黄酮得率影响程度越大,反之,越平缓影响则越小[29]。分析图7三维曲面图可以看出,料液比曲面比超声温度曲面坡度陡峭,即固定其他因素不变,讨论料液比与超声温度交互作用对松针总黄酮得率影响大小,改变料液比对总黄酮得率影响较超声温度大。同理分析图9,可以得到固定其他因素不变,改变乙醇体积分数的大小对松针总黄酮得率的影响比改变超声温度大,这与二元回归方程系数相吻合。等高线的形状越趋于圆形,表明两因素的交互作用不显著,越趋于椭圆形,则交互作用越显著,趋于椭圆形,且椭圆与两轴之间形成一定的角度,则交互作用极显著[30-32],分析图11超声时间与温度交互作用等高线图趋于椭圆,且椭圆与两轴之间有一定的角度,因此交互作用极显著;分析图9超声温度与乙醇体积分数交互作用等高线图较趋于椭圆形且与两轴有一定角度,交互作用较显著;同理分析图7超声温度与料液比等高线图趋于椭圆形,且椭圆形与两轴之间也存在一定角度,交互作用显著,其余的不显著,与方差表分析一致。

2.4　工艺优化及验证实验

结合单因素实验,通过响应面法建立二次回归模型,并通过方差分析,得出提取方法合理可靠。采用响应曲面分析可得东北红松松针黄酮最优提取条件:料液比1∶51.6 g/mL,超声温度76.27 ℃,乙醇体积分数50.87%,超声时间102.91 min,此时总黄酮得率为5.89%。结合实验室操作条件,经验证确定东北红松松针黄酮提取条件为:料液比1∶52 g/mL,超声温度76 ℃,乙醇体积分数51%,超声时间103 min,三次平行实验取平均值,最后得到总黄酮得率为5.82%。

3　结论

针对东北地区丰富的红松松针资源,以优化红松针黄酮的超声辅助提取方法为目的,且通过实验优化提取条件,确定最佳提取工艺为:料液比1∶52 g/mL,超声温度76 ℃,乙醇体积分数51%,超声时间103 min,总黄酮得率可达到5.82%,超声波法辅助乙醇提取东北红松松针黄酮,成本低,操作简洁方便。比起传统的溶剂提取法,超声波的空穴作用更易使黄酮类物质溶出,提高了松针黄酮的提取率,为东北松针资源的开发利用提供可行性依据。

[1]司洪生. 关于我国红松分类与分布的探讨[J]. 林业科技通讯,2015,57(8):3-5.

[2]谢济运. 松针有效成分的提取与分析研究进展[J]. 安徽农业科学,2011,39(22):13498-13500,13512.

[3]Xiaofeng Shi,Dongyan Liu,Junmin Zhang,et al. Extraction and purification of total flavonoids from pine needles ofCedrusdeodaracontribute to anti-tumorinvitro[J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine,2016,16(1):245-253.

[4]Dongyan Liu,Xiaofeng Shi,Dongdong Wang. et al. A new flavonoid in pine needles ofCedrusdeodara[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,2011,3(1):5-6.

[5]T V Hurshkainen,V I Terentyev,N N Skripova,et al. The study of the chemical composition of pine cedar extract[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry,2015,41(7):753-756.

[6]Jeon J R,Kim J Y. Effects of pine needle extract on differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and obesity in high-fat diet fed rats[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin,2006,29(10):2111-2115.

[7]Chaudhary A K,Ahmad S,Mazumder A. Cognitive enhancement in aged mice after chronic administration ofCedrusdeodaraLoud. andPinusroxburghiiSarg. with demonstrated antioxidant properties[J]. Journal of Natural Medicines,2014,68(2):274-283.

[8]Chenxi Wang,Yuping Li,Lihua Yao,et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoid fromPortulacaoleraceaL. by sponse surface methodology and chemical composition analysis[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2014,57(5):647-653.

[9]曾菲,魏芳,夏道宗. 松针总黄酮提取工艺的优化及复合袋泡茶的研制[J]. 中国食物与营养,2015,21(2):53-56.

[10]林楚慧,陈宣伶,郑文玮,等.马尾松松针抗氧化酸奶加工工艺研究[J]. 中国乳品工业,2014(6):58-61.

[11]吕静,贾凌云,袁久志,等. 红松松针化学成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报,2011,28(1):21-24,54.

[12]高岩,袁久志,王禹孝,等. 红松松针中黄酮类成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报,2010,27(7):539-543.

[13]战英,陈丽娜,石矛. 微波辅助提取红松松针总黄酮工艺优化[J]. 食品研究与开发,2015,36(16):69-72.

[14]文攀,王振宇,裴志胜. 响应面法优化红松松籽壳总黄酮的超声提取工艺研究[J]. 中国食品添加剂,2016,26(6):73-79.

[15]陶波,方梅,张嘉男,等. 沙冬青种子总黄酮测定方法及纯化工艺研究[J]. 生物技术通报,2017,33(5):63-70.

[16]李怡铮,梁铁强,王立娟. 超声辅助提取黑皮油松松针黄酮及其稳定性[J]. 东北林业大学学报,2016,44(6):89-91.

[17]翁旭东,刘凡,刘翀,等.应用响应面法优化超声波辅助乙醇提取桑根皮总黄酮的工艺条件[J].蚕业科学,2015,41(6):1071-1076.

[18]阙淼琳,蒋玉蓉,曹美丽,等. 响应面实验优化藜麦种子多酚提取工艺及其品种差异[J]. 食品科学,2016,37(4):7-12.

[19]刘琼,王仁才,吴小燕,等. 响应面法优化超声波提取鸡蛋枣原花青素工艺[J]. 食品工业科技,2017,38(16):182-188.