香圆枳壳柚皮苷的提取及其对亚硝酸盐的清除作用

2018-04-13，

食品工业科技 2018年4期

，　

(陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西汉中 723000)

枳壳(FructusAurantii)为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)、代代花(C.a.var.amara)、香圆(Citruswilsonii)及其枸橼(Poncirustrifoliata)的干燥幼果与未成熟果实[1]。香圆枳壳始载于《神农本草经》,其性苦、辛、酸、温,具有理气宽中、行滞消胀的功效[2],主治胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子官脱垂等病症,为历版《中国药典》所收载[3],也是国家卫生部所颁布的可用于保健食品的原料[4]。现代研究表明,香圆枳壳的主要成分为黄酮类物质、生物碱以及挥发油类[5-6]。其中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷是香圆枳壳中的的主要黄酮类物质,黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抑菌抗炎、抗过敏等多种生物活性[7-8],因而在功能保健食品开发中应用广泛[9]。然而关于香圆枳壳柚皮苷的研究报道很少,尤其缺乏复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷及其清除亚硝酸盐的研究[10-13]。因此,采用复合酶法从香圆枳壳中提取柚皮苷并研究其亚硝酸盐的清除作用,不仅可充分利用当地的香圆资源,增加香圆产业的附加值,而且可为香圆枳壳柚皮苷的工业化开发提供理论支持。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

枳壳香圆的干燥幼果,50 ℃干燥,粉碎备用,购于汉中中药材批发市场;柚皮苷标准品中国药品生物制品鉴定所;果胶酶(4000 U/mg)、纤维素酶(10000 U/mg)和氏璧生物技术有限公司;乙醇、甲醇、HCl、NaOH、硫酸、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺等均为分析纯。

ZN-02粉粹机北京兴时利和科技有限公司;TU-1221紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器公司;QCD6150数控超声清洗器天津恒瑞机电设备有限公司;TDL-40B离心机上海安亭科学仪器厂;AL204电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DHF-9055A电热鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司;RE5298旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂。

1.2　实验方法

1.2.1复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷工艺流程

1.2.2单因素实验精密称取5.00 g原料,加入一定质量的果胶酶和纤维素酶(质量比1∶1)的复合酶,在一定pH,温度45 ℃条件下超声处理,提取液离心(3000 r/min,20 min)后取上清液,进行测定,计算柚皮苷得率。分别考察pH(超声时间30 min,超声功率300 W,加酶量120 μg/g条件下,pH分别为3、4、5、6、7、8);超声时间(pH6,超声功率300 W,加酶量120 μg/g条件下,超声时间分别为20、25、30、35、40、45 min);超声功率(pH6,超声时间30 min,加酶量120 μg/g条件下,超声功率分别为100、150、200、250、300、350 W);加酶量(pH6,超声时间30 min,超声功率300 W条件下,加酶量分别为80、100、120、140、160、180 μg/g)等因素对香圆枳壳柚皮苷提取效果的影响。

1.2.3响应面实验在单因素实验基础上,根据Box-Benhnken的实验设计原理,选取pH、超声时间、超声功率和加酶量为考察对象,以柚皮苷得率为响应值,设计四因素三水平的响应面分析。研究各因素对香圆枳壳柚皮苷提取效果的影响,实验因素与水平设计见表1。

表1　响应面分析因素与水平Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.4柚皮苷标准曲线的制作准确称取柚皮苷标准品10.00 mg,甲醇充分溶解并定容至100 mL,再分别准确吸取上述贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,由于柚皮苷在Al(NO3)3溶液中能形成黄色络合物,在最大吸收峰波长420 nm处测吸光度,可得吸光度A与柚皮苷浓度C(μg/mL)的标准曲线方程:Y=0.013X+0.0657,R2=0.9983,X为标准品的浓度,Y为吸光度。

1.2.5柚皮苷得率的测定精密称取5.00 g原料,按照方法“1.2.1”进行香圆枳壳柚皮苷的提取,制的柚皮苷的提取液并定容,按照方法“1.2.4”于420 nm处测其吸光度,根据柚皮苷标准曲线计算柚皮苷浓度,并按下式计算香圆枳壳柚皮苷的得率:

得率(%)=(C×N×V/W×100)×100

式中,C为样液中柚皮苷浓度,μg/mL;N为提取液的稀释倍数,50;V为粗提液体积,mL;W为香圆枳壳粉质量,g[17-19]。

1.2.6柚皮苷对亚硝酸盐的清除作用参照刘钢等[20]方法进行修改。比色管中分别加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液、一定量的香圆枳壳柚皮苷提取液,混合均匀,之后加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液混匀,静置5 min,加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液,混匀后静置15 min,加蒸馏水定容至50 mL,测定538 nm波长处吸光度(A样品),同时以蒸馏水代替亚硝酸标准溶液作为空白对照实验测定吸光度(A样空),以蒸馏水代替香圆枳壳柚皮苷提取液的空白对照测定吸光度(A对照)。以茶多酚为阳性对照。亚硝酸盐清除率按下式计算:

1.3　数据处理

实验数据均为三次实验数据的平均值,利用Design Expert V 8.0.6进行响应面实验数据分析,建立数学模型。

2　结果与分析

2.1　复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷工艺优化

2.1.1不同pH对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响由图1可以看出,在实验范围内,香圆枳壳柚皮苷得率随着pH增大先升高,到达最高点后呈缓慢下降趋势,在pH为6时,香圆枳壳柚皮苷提取效果较好,这是因为此时酸碱性环境最适合复合酶作用于原料,如果pH继续上升,则酶的空间结构就会受到影响,导致其活性下降[21]。

图1　不同pH对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.1　Effect of different pH on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.2不同超声时间对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响由图2可以看出,随着超声处理时间的增加,香圆枳壳柚皮苷得率会逐渐提高。在超声时间为35 min时,枳壳柚皮苷得率达到最高水平,如果大于35 min时,枳壳柚皮苷得率会开始下降,这可能是因为在较长超声波时间作用下,枳壳柚皮苷会分解[18]。因此,超声波时间为35 min时,枳壳柚皮苷提取效果较好。

图2　不同超声波时间对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.2　Effect of different ultrasonic time on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.3不同超声功率对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响由图3可以看出,当超声波功率上升后,枳壳柚皮苷得率也会相应提高,当超声波功率达到250 W时,枳壳柚皮苷得率上升到峰值,随着超声波功率继续上升,枳壳柚皮苷得率会大幅减少。这是因为超声波功率上升后,复合酶活性相应下降,枳壳柚皮苷得率相应下降[22-23]。因此,超声波功率为250 W时,枳壳柚皮苷提取效果较好。

图3　不同超声波功率对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.3　Effect of different ultrasonic power on naringin extraction from Fructus Aurantii

图4　不同加酶量对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响 Fig.4　Effect of different enzyme dosage on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.4不同加酶量的提取效果由图4可以看出,随着加酶量增长枳壳柚皮苷得率相应增大,当加酶量达到120 μg/g后,加酶量继续增大,枳壳柚皮苷得率反而有所下降,这主要是因为加酶量已经达到了饱和状态;如果加酶量继续增大,枳壳柚皮苷得率波动范围较小[24]。因此加酶量为120 μg/g时,枳壳柚皮苷提取效果较好。

2.1.5复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷工艺优化实验分析复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷的条件可知,pH、超声波时间、超声波功率、加酶量这4个因素都是显著因素。得率的二次回归拟合方程如下:

得率(%)=3.20-0.32A-0.19B-0.42C+0.28D+0.14AB+0.22AC-0.38AD+0.14BC-0.36BD-0.17CD-0.64A2-0.44B2-0.56C2-0.23D2。回归方程中二次项的系数均为负数,说明回归方程存在稳定点,即极大值点。

表2　复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷响应面试验结果Table 2　Response surface experiment results of composite enzyme assisted extraction of naringin from Citrus wilsonii Fructus Aurantii

表3　回归方程各项的方差Table 3　Variance of regression equation

注：* 差异显著,p<0.05,**差异极显著,p<0.01。

图5　pH和超声波时间相互作用对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.5　Effect of pH and ultrasonic time on extraction of naringin from Fructus Aurantii

图7　pH和加酶量相互作用对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.7　Effect of pH and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

图8　超声波时间和超声波功率相互作用对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.8　Effect of ultrasonic time and ultrasonic power on extraction of naringin from Fructus Aurantii

图9　超声波时间和加酶量相互作用对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.9　Effect of ultrasonic time and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

图10　超声波功率和加酶量相互作用对香圆枳壳柚皮苷提取效果影响Fig.10　Effect of ultrasonic power and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

响应曲面倾斜度大小表示相关因素的交互影响大小，图5～图10表示A、B、C、D四个因素之间的交互作用对香圆枳壳柚皮苷得率的影响。由图5～图10及p值分析可以看出，pH和超声波时间、pH和超声波功率、pH和加酶量、超声波时间和超声波功率、超声波时间和加酶量、超声波功率和加酶量对香圆枳壳柚皮苷得率的两两交互作用明显，与方差分析结果一致。得到复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷的最佳条件为pH5.32，超声波时间32.27 min，超声波功率230.16 W，加酶量134.31 μg/g，在此工艺条件下，软件程序对香圆枳壳柚皮苷得率的预测值为3.81%。

2.1.6验证实验对模型进行验证，考虑实验的可操作性，将复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷的最佳提取条件调整为：pH5.3，超声波时间32 min，超声波功率230 W，复合酶添加量134 μg/g，在此工艺条件下，进行5次平行验证试验，结果表明，香圆枳壳柚皮苷的得率为3.75%，RSD为1.16%(n=5)，表明响应面建立的复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷数学模型对香圆枳壳柚皮苷提取稳定可靠，能指导实际生产应用。

图11　香圆枳壳柚皮苷对亚硝酸盐清除率影响Fig.11　Effect of naringin from Fructus Aurantii on clearance to nitrite

2.2　香圆枳壳柚皮苷对亚硝酸盐的清除作用

由图11可知,随着香圆枳壳柚皮苷和茶多酚浓度增大,香圆枳壳柚皮苷和茶多酚对亚硝酸盐清除能力均逐渐增强,当香圆枳壳柚皮苷浓度小于或等于1 mg/mL时,其清除亚硝酸盐的能力小于茶多酚,当香圆枳壳柚皮苷浓度大于1 mg/mL时,其清除亚硝酸盐的能力增强得较快,对亚硝酸盐的清除率大于茶多酚,当香圆枳壳柚皮苷浓度达到3 mg/mL,其对亚硝酸盐的清除率可达到91.1%。

3　结论

为充分利用香圆枳壳资源,本实验以香圆枳壳为原料,采用果胶酶和纤维素酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷,对其最佳提取工艺进行探讨,响应面优化香圆枳壳柚皮苷提取实验模型和实际情况拟合度比较好,复合酶辅助提取香圆枳壳柚皮苷的最佳工艺条件为pH5.3,超声时间32 min,超声功率230 W,加酶量134 μg/g。在此工艺条件下,香圆枳壳柚皮苷实际得率为3.75%。

香圆枳壳柚皮苷对亚硝酸盐的清除实验表明:随着浓度增大,香圆枳壳柚皮苷对亚硝酸盐清除能力逐渐增强,当香圆枳壳柚皮苷浓度达到3 mg/mL,其对亚硝酸盐的清除率可达到91.1%。本实验结果可为香圆枳壳的综合开发利用提供新的思路,为开发亚硝酸盐天然清除剂提供理论支持。

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