不同杀菌温度对生乳指标的影响

文/周 颖　黄 锐

（中垦华山牧乳业有限公司）

牛乳中营养物质丰富，含有多种氨基酸、维生素、微量元素等，是微生物繁殖的理想环境，因此杀菌是生乳加工过程中的重要步骤之一[1]。然而乳中含有多种热敏性的活性物质，过高的杀菌温度必然导致乳中的营养物质损失。所以生乳的热处理应包含2个目的：一是保证产品的安全性；二是使产品更健康。糠氨酸是衡量生乳热处理程度的常用指标，加热程度越高，糠氨酸含量越高。生乳中最重要的活性蛋白包含乳过氧化物酶、乳铁蛋白和α-乳白蛋白，它们具有多种功能特性和生物活性，研究最为广泛和深入[2～4]。近年来，巴氏杀菌乳受到消费者的青睐，它不仅保证了产品中的活性物质，又能有效杀死致病菌。然而，不同巴氏杀菌温度对乳中成分的影响程度尚且不明确，本文利用利乐杀菌机对生乳进行不同温度的巴氏杀菌，通过检测初步了解菌落总数、糠氨酸含量、过氧化物酶活性以及乳铁含量的变化情况，为巴氏杀菌温度提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1　培养基

平板计数琼脂培养基，121℃灭菌15min。

1.2　主要试剂

乳铁蛋白试剂盒，荷兰EuroProxima公司；糠氨酸标准品（肽纯度72.6%），法国Polypeptide公司；过氧化酶试剂盒，意大利CDR FoodLab。

1.3　仪器与设备

1260Infinity液相色谱仪，美国Agilent；Atlantis®dC18色谱柱，美国Waters；Kjeltec 8400自动凯氏定氮仪，丹麦FOSS；SLB222CDR FoodLab Touch analyzer，意大利CDR FoodLab；KQ5200V超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；BSP-800生化培养箱，上海博讯实业有限公司；YXQ.WF32A卧式蒸汽灭菌器，四川射洪通用医疗器械有限公司；SC/DT400J2冷藏柜，黄石东贝制冷有限公司。

1.4　方法

1.4.1菌落总数测定

按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的要求进行检测[5]。

1.4.2糠氨酸含量测定

对样品中的糠氨酸含量按照如下步骤进行测定[6，7]。

表1　洗脱梯度

1.4.2.1样品水解液准备

吸取2.00mL样品，置于密闭耐热试管中，加入6.00mL 10.6mol/L盐酸溶液，混匀。密闭试管置于110℃烘箱中加热水解12～23h。加热约1h后，轻轻摇动试管。加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后用滤纸过滤，滤液供测定。

1.4.2.2样品中蛋白质含量测定

称取2.00mL样品水解液，按GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》的要求进行检测[8]。

1.4.2.3糠氨酸标准储备液和标准工作溶液的制备

糠氨酸标准储备液（500.0mg/L）：称取6.89mg糠氨酸标准品，用3mol/L盐酸溶液溶解并定容至10mL，即制得500mg/L的糠氨酸标准储备溶液。

糠氨酸标准工作溶液（2.0mg/L）：移取100μL糠氨酸标准储备溶液于25mL容量瓶，用3mol/L盐酸溶液溶解并定容，即制得2.0mg/L的糠氨酸标准工作溶液。

1.4.2.4液相色谱检测

移取1.00mL样品水解液，加入5.00mL的6g/L乙酸铵溶液，混匀，过0.22μm水相滤膜，滤液供上机测定。

采用Agilent液相色谱仪分析。色谱柱为Atlantis®dC18色谱柱，4.6mm×250mm×5μm粒径；检测器为Agilent G7114A紫外检测器；柱温32℃；波长280nm；流动相：0.1%三氟乙酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B；进样量10μL。洗脱梯度如表1所示。

1.4.2.5糠氨酸含量计算

糠氨酸含量以质量分数F计，数值以毫克每百克蛋白质（mg/100g蛋白质）表示。

式中：At为样品中糠氨酸峰面积的数值；Astd为糠氨酸标准溶液中糠氨酸峰面积的数值；Cstd为糠氨酸标准溶液的浓度，单位为mg/L；D为测定时稀释倍数（D=6）；m为样品水解液中蛋白质浓度，单位为g/L。

1.4.3过氧化物酶活性测定

按照过氧化酶试剂盒说明书操作。

1.4.4乳铁蛋白含量测定

按照乳铁蛋白试剂盒说明书操作。

1.4.5试验方法

1.4.5.1生乳菌落总数和过氧化物酶活性的测定。

1.4.5.2通过设定利乐多功能巴氏杀菌机参数，对生乳分别进行72℃、73℃、74℃、75℃和80℃杀菌，杀菌保持时间一致，分别取样用于菌落总数、糠氨酸含量、过氧化物酶活性、乳铁蛋白含量的检测。平行试验为4次。

2　结果与分析

2.1　生乳菌落总数

各平行试验检测的生乳菌落总数如表2所示。可以看出，用于试验的生乳菌落总数指标平均值在1.2×103CFU/mL，远远低于国家标准2×106CFU/mL，生乳的微生物指标决定了巴氏杀菌后样品的菌落总数的整体水平。

2.2　不同杀菌温度下菌落总数的变化

不同杀菌温度下菌落总数变化如图1所示。可以看出，72℃、73℃的杀菌温度下，菌落总数无显著性差异，在74℃有较明显的下降趋势，而74℃、75℃和80℃的菌落总数无显著性差异。但在72～80℃均能达到较好的巴氏杀菌效果，符合国家巴氏杀菌乳的要求[9]。

2.3　不同杀菌温度下糠氨酸含量的变化

不同杀菌温度下糠氨酸含量的变化如图2所示。可以看出，生乳和72℃杀菌温度下产品的糠氨酸含量无显著差异；73℃、74℃、75℃杀菌的糠氨酸含量无显著性差异；80℃杀菌下糠氨酸含量与其它杀菌温度的产品有显著性差异。

表2　生乳菌落总数

图 1不同杀菌温度下菌落总数变化

图 2不同杀菌温度下糠氨酸含量的变化

图 3不同杀菌温度下过氧化物酶活性的变化

图 4不同杀菌温度下乳铁蛋白含量的变化

2.4　不同杀菌温度下过氧化物酶活性的变化

不同杀菌温度下过氧化物酶活性的变化如图3。可以看出，生乳，在72℃、73℃、74℃、75℃、80℃杀菌后，过氧化物酶活性有显著性差异，在80℃时活性仅为126U/L。这说明过氧化物酶活性对温度较敏感。相关研究表明[10]，乳的过氧化物酶在85℃的杀菌温度下失活，与本文研究相一致。

2.5　不同杀菌温度下乳铁蛋白含量的变化

不同杀菌温度下乳铁蛋白含量的变化如图4所示。可以看出，72℃、73℃、74℃、75℃杀菌的乳铁蛋白含量无显著性差异，在80℃时有显著性下降。

3　小结

近年来，对乳铁蛋白和乳过氧化物酶功能特性的研究不断深入，乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，具有多种功能特性，包括抑菌、抗氧化、抗炎症、抑制癌细胞发展和转移等[11，12]；大量的体内和体外实验表明，乳铁蛋白及其衍生肽能够抑制肿瘤的生长[13，14]，同时不会对正常细胞产生任何副作用[15]。乳过氧化物酶对生乳有重要的保护作用，具有广泛的抑菌效果[16]，它的抗氧化作用能够降解致癌物质[17，18]。

巴氏杀菌温度对产品的营养价值和安全性有重要的影响，本文研究表明：72℃、73℃杀菌后，菌落总数无显著差异，74℃、75℃、80℃有显著性下降，但均能到达很好的杀菌效果；随着加热温度的升高，糠氨酸含量有显著性增加，维持在6mg/100g蛋白质以下；过氧化物酶活性随着杀菌温度的升高而显著性下降，在80℃时仅为126U/L；72℃、73℃、74℃和75℃的杀菌后，乳铁蛋白含量无显著性变化，而在80℃时有显著性下降，最低值在24mg/kg。研究表明，过氧化物酶活性对温度极为敏感，可作为杀菌温度对乳中活性物质影响的参考依据，对工业生产提供了一定的指导作用。C

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