类风湿性关节炎大鼠模型的构建及免疫相关基因mRNA表达的研究

阚秋琪1，陈玉霜1，薛娇1，冯笑1，董轩1，潘士锋，邢华



类风湿性关节炎大鼠模型的构建及免疫相关基因mRNA表达的研究

阚秋琪1，陈玉霜1，薛娇1，冯笑1，董轩1，潘士锋1, 2，通信作者，邢华1, 2，通信作者

（1. 扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

为了比较类风湿性关节炎大鼠模型建模效果，并探究免疫相关基因mRNA的表达，本研究分别采用胶原（CIA）和完全弗氏佐剂（AA）两次皮内注射方法制备大鼠模型，对照组（C组）注射等体积生理盐水，以足趾肿胀值判断成模情况。在造模后不同时间点，采用ELISA试剂盒测定血清中细胞因子IL-1β的含量，运用RT-PCR方法检测脾组织中免疫相关基因PD-1、TGF-β1和Foxp3 mRNA的表达。结果显示，AA组和CIA组大鼠足趾肿胀值均显著增大（CIA＞AA＞对照组），血清IL-1β浓度在第2周与第4周显著升高（CIA＞AA＞对照组），脾组织中PD-1、TGF-β1和Foxp3 mRNA表达显著降低（CIA＜AA＜对照组）。以上结果表明，CIA 和AA注射均可成功制备RA模型，且CIA模型较AA模型成模效果更好，IL-1β在RA发病中起着至关重要的作用。

大鼠；类风湿性关节炎；模型；免疫相关基因；评估

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种严重危害人类健康的慢性自身免疫性疾病，其病因及发病机制至今尚不完全清楚。目前，关于RA模型的制备有多种方法，不同制备方法各有其优缺点[1]，其中以胶原诱导性关节炎模型（collagen induced arthritis, CIA）和佐剂性关节炎模型（adjuvant induced arthritis, AA）最为经典且应用最为广泛[2]。成功制备RA模型，筛选出RA发病过程中的关键免疫因子，对基因治疗RA起着至关重要的作用。因此，本试验以大鼠作为对象，分别选用胶原和佐剂诱导的造模方法，并检测血清免疫相关细胞因子IL-1β的浓度以及脾组织中PD-1、TGF-β1和Foxp3 mRNA的表达，从而筛选出类风湿关节炎的理想制备方案，并探索RA发生过程中机体内关键免疫因子的改变，以期为基因治疗RA方面的研究提供理论支撑。

1 材料

1.1 试验动物

SPF级雌性Wistar大鼠，体重160～180 g，扬州大学比较医学中心提供，试验动物使用许可证号SYXK（苏）2017-0044。使用Co60灭菌的商品化大鼠饲料，自由饮水采食，自然光照，饲养温度18～25 ℃，饲养湿度60%～70%。

1.2 主要仪器

StepOne Real-Time PCR System，美国ABI公司生产；Thermal Cycler 2720型PCR仪，美国ABI公司生产；电泳仪PROTEAH，英国Bio-Rad公司生产；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司生产；INFINITY凝胶成像系统，法国VL公司生产；Infinite®M200 PRO多功能酶标仪，瑞士Tecan公司生产。

1.3 主要试剂

鸡II型胶原蛋白、完全弗氏佐剂、DEPC均来自Sigma公司；TRIZOL来自Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR ®Premix Ex TaqTMⅡ、Rat IL-1β ELISA Kit，均由Takara生产。

2 方法

2.1 模型的建立

按文献方法并加以改良，进行CIA模型[3]和AA模型[4]的建立。选取30只Wistar大鼠，适应一周后，随机分为对照组（C组）、胶原诱导性关节炎模型组（CIA组）和佐剂性关节炎模型组（AA组），每组10只，分2次免疫造模。初次免疫时，CIA组尾根部分点皮内注射1 mg/mL鸡II型胶原乳化液1 mL；AA组尾根部分点皮内注射完全弗氏佐剂1 mL；C组尾根部分点皮内注射生理盐水1 mL。7 d后加强免疫，CIA组腹腔注射l mg/mL鸡II型胶原乳化液0.5 mL，AA组腹腔注射完全弗氏佐剂0.5 mL，C组腹腔注射生理盐水0.5 mL。

本试验用足趾肿胀值检测作为衡量模型指标。0 d 时在大鼠踝关节同一地方做标记，用游标卡尺测量大鼠双后肢足趾肿胀值，以后每1 周测量一次，测量5周。

2.2 血清中细胞因子IL-1β浓度的检测

分别于造模后0、2、4周，以毛细管法从眼眶后静脉丛取血，并制备血清1 mL，采用ELISA试剂盒法检测血清中细胞因子IL-1β浓度。

2.3 脾组织PD-1、TGF-β1和Foxp3 mRNA表达检测

2.3.1 引物设计

依据NCBI数据库中大鼠PD-1、TGF-β1和Foxp3以及内参β-actin基因序列，应用Primer 5.0引物设计软件设计引物（表1）。

表1 PD-1基因引物序列

2.3.2 脾组织总RNA的提取

取造模后4周的成功模型大鼠，每组5只。处死动物后，迅速取适量脾组织，置于-80 ℃冰箱保存备用。按试剂盒操作说明，用TRIZOL法提取总RNA。

2.3.3 cDNA第一条链合成反应（反转录，RT）

按反转录试剂盒操作步骤进行RT。

2.3.4 普通PCR

以PD-1、TGF-β1、Foxp3以及内参β-actin引物进行PCR扩增，检测正常大鼠、成功模型鼠PD-1、TGF-β1和Foxp3的特异性。

2.3.5 荧光定量PCR检测PD-1、TGF-β1和Foxp3基因mRNA表达

PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；PCR反应95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸5 s，共40个循环。熔解曲线检测条件：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。

2.4 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，计量资料用±表示，多组间比较采用方差分析，组间比较用检验。

3 结果

3.1 足趾肿胀值

如图1所示，与正常组大鼠相比，CIA 和AA模型组大鼠足趾肿胀值在造模后1周、2周、3周、4周、5周均显著增大。相比较而言，在造模前2周，AA模型组大鼠足趾肿胀更加显著，病程起病急，但是肿胀维持时间不持久，3周后肿胀开始消退。CIA模型组大鼠3周后足趾肿胀值达到病程的最高峰，之后增加趋于稳定，从第4周开始，CIA模型组大鼠足趾肿胀值显著大于AA模型组大鼠。

图1 大鼠足趾肿胀情况

注：*代表与control组相比，差异显著（＜0.05）；**代表与control组相比，差异极显著（＜0.01）；△△代表CIA组与AA组相比，差异极显著（＜0.01）

3.2 血清中细胞因子IL-1β的浓度

造模后每2周检查一次血清中细胞因子IL-1β浓度，结果发现CIA和AA模型组大鼠血清中IL-1β含量随着病程的发展上升明显（表2），2周、4周均极显著高于对照组大鼠（＜0.01），并且CIA模型组上升趋势更加明显。CIA模型组大鼠血清中IL-1β浓度极显著高于AA模型组（＜0.01）。

表2 大鼠血清IL-1β测定值 pg/mL

注：*代表与control组相比，差异显著（＜0.05）；**代表与control组相比，差异极显著（＜0.01）；△△代表CIA组与AA组相比，差异极显著（＜0.01）

3.3 脾组织中PD-1、TGF-β1和Foxp3基因mRNA表达

3.3.1 PD-1、TGF-β1和Foxp3基因的定性结果

从大鼠脾组织中提取总RNA，经紫外分光光度计测定，样品在260 nm处有最大吸收峰值，OD 260/280均在1.9～2.1之间，说明提取的总RNA纯度高。通过普通PCR，可见PD-1、TGF-β1和Foxp3基因在大鼠脾组织中均有表达，扩增片段条带特异性好，片段长度分别为289、341、281 bp，与预期片段大小一致（图2），可用于后续的定量PCR分析。

图2 琼脂糖凝胶验证Marker、β-action、PD-1、TGF-β1和Foxp3 PCR结果

注：M为Marker；1为β-actin；2为PD-1；3为TGF-β1；4为Foxp3

3.3.2 脾组织中PD-1、TGF-β1和Foxp3基因mRNA表达

与对照组大鼠（1.00±0.07）相比，CIA组、AA组大鼠PD-1的mRNA表达量分别为0.12±0.08和0.45±0.08，3组之间PD-1的mRNA表达量彼此间均存在显著差异（图3）。

图3 模型大鼠脾组织中PD-1 mRNA的相对表达量图

注：*代表与control组相比，差异显著（＜0.05）；**代表与control组相比，差异极显著（＜0.01）；△△代表CIA组与AA组相比，差异极显著（＜0.01）

与对照组大鼠（1.00±0.06）相比，CIA组、AA组大鼠的TGF-β1基因mRNA表达量分别为0.12±0.06和0.48±0.07，3组之间TGF-β1的mRNA表达量彼此间均存在显著差异（图4）。

图4 模型大鼠脾组织中TGF-β1 mRNA的相对表达量图

注：*代表与control组相比，差异显著（＜0.05）；**代表与control组相比，差异极显著（＜0.01）；△△代表CIA组与AA组相比，差异极显著（＜0.01）

与对照组大鼠（1.00±0.08）相比，CIA组大鼠与AA组大鼠Foxp3的mRNA表达量为0.23±0.09和0.74±0.03，3组之间Foxp3的mRNA表达量两两之间存在显著差异（图5）。

图5 模型大鼠脾组织中Foxp3 mRNA的相对表达量图

注：*代表与control组相比，差异显著（＜0.05）；**代表与control组相比，差异极显著（＜0.01）；△△代表CIA组与AA组相比，差异极显著（＜0.01）

4 讨论

类风湿关节炎是一种以关节膜慢性炎症为主的自身免疫性疾病，其发病机制尚不明确，也没有疗效显著的治疗方法，理想RA模型的构建与确认对RA的基础研究和临床治疗十分重要。目前，RA模型存在多种构建方法，各有其优缺点。其中应用较为广泛的是CIA和AA型，以往研究表明两种模型在临床表现、实验室指标和病理机制上都与人临床上的RA相似，是研究RA临床治疗的较理想模型[5]。因此，本研究中选择CIA和AA两次皮内注射的方法进行RA模型的构建。

足趾肿胀值是衡量RA模型构建成功与否的一个非常重要指标。本研究发现，CIA和AA模型组大鼠足趾肿胀值均显著高于对照组，研究结果与以往的研究结果一致[6]，表明CIA和AA均能成功诱导RA模型。此外还发现，在造模前2周，AA模型组大鼠足趾肿胀值增加更加明显，病程起病急，但是肿胀维持时间不持久，3周后肿胀开始消退，而CIA模型组大鼠3周后足趾肿胀值达到病程的最大值，之后增加趋于稳定。因此，对两组模型进行综合比较发现，CIA模型效果更佳。

关于RA的病理机制在以往已有许多报道，研究主要集中在细胞因子等水平上。有研究证实，IL-1β是参与RA进展期关节破坏的典型前炎症细胞因子，在RA的进展中起着决定性作用[7]。对于RA患者滑膜液的研究发现，IL-1β在滑膜液中表达极高[8]。本研究也发现，CIA和AA两组模型组大鼠血清中IL-1β含量随着病程的发展上升明显，造模2、4周均极显著高于对照组大鼠，并且CIA模型组上升趋势更加明显，以上研究结果进一步证实了IL-1β在RA发病过程中的关键性作用，也为后续基因治疗RA筛选关键基因提供理论支撑。

此外，本试验还发现PD-1、TGF-β1和Foxp3的mRNA表达量在CIA和AA模型组大鼠均显著下降，并且CIA模型中大鼠下降更明显。PD-1、TGF-β1和Foxp3是类风湿关节炎的重要免疫相关因子。研究表明，T细胞的过度活化是导致RA滑膜炎的重要原因，PD-1作为CD28/CTLA-4家族成员之一[9]，在T细胞增殖活化中起着至关重要的作用[10]。因此，本试验发现CIA组与AA组模型PD-1 mRNA表达显著低于对照组，与理论研究一致，表明PD-1有可能在RA发病过程发挥重要作用。但也有研究发现，PD-1阳性细胞可能不参与类风湿性关节炎的发生发展过程[11]。因此，PD-1在RA发病中的具体作用还有待于进一步研究。

TGF-β是一种多效能生长因子, 它可刺激细胞外基质分泌, 参与多种免疫细胞的生长与分化, 有拮抗炎症细胞因子的作用。有研究表明，RA患者体内的Treg细胞数量会显著减少且输注Treg细胞后RA症状得到改善[12]，而TGF-β1和Foxp3都可影响Treg的产生，TGF-β1可诱导Foxp3表达[13]，Foxp3又是Treg细胞的关键核转录因子[14]，因而TGF-β1和Foxp3的高表达可以抑制自身免疫病和保护损伤的组织。本试验中，模型鼠体内的TGF-β1和Foxp3 mRNA表达均显著低于正常组大鼠，可由此推断模型鼠体内Treg细胞数量也极低，与上述结论一致。有文献指出，TGF-β1具有双重作用，一方面可导致RA曲型滑膜改变，加速病情发展，另一方面可抑制免疫作用，保护软骨组织完整性[15]，所以对于TGF-β1的作用的研究还不完全，需要进一步研究。

本研究结果发现，CIA和AA均能成功构建RA模型，并且CIA模型效果更佳。此外，现有研究表明IL-1β在类风湿性关节炎的发生、发展中起着至关重要的作用，相信随着对其研究的深入，将会对揭示类风湿关节炎的发病机制产生重大影响。

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责任编辑：张爱婷

Establishment of rat model of rheumatoid arthritis and the mRNA expression of immune related genes

KAN Qiu-qi1, CHEN Yu-shuang1, XUE Jiao1, FENG Xiao1, DONG Xuan1，PAN Shi-fengCorresponding Author, XING Hua1, 2, Corresponding Author

（1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China; 2. Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China）

In order to compare modeling effect of rats with rheumatoid arthritis and to explore the mRNA expression of immune related genes.In the present study, intradermal injection of collagen（CIA）and complete freund's adjuvant（AA）were used to establish the RA rat model, while the control rats were injected with equal volume of physiological saline. Formation of toe swelling value was used to judge the success of the model. Furthermore, ELISA was used to detect the IL-1β level in serum and the mRNA expression of immune related genes PD-1, TGF-β1 and Foxp3 in spleen tissue were determined by RT-PCR at different time points after operation.Compared with control group, formation of toe swelling value in CIA and AA group were increased significantly, in addition, serum IL-1β concentrations of CIA and AA rats in the second and fourth weeks of testing were higher significantly. PD-1, TGF-β1 and Foxp3 mRNA expression in the spleen were significantly lower in CIA and AA rats after four weeks of modeling. And all above changes in CIA rats were more obvious than AA rats. The above results showed thatboth methods can successfully establish rat model of rheumatoid arthritis, CIA method is better than AA, and IL-1β plays an important role in the progress of RA.

rat; rheumatoid arthritis; model; immune related gene; evaluation

S865.1；Q786

A

1008-5394（2018）01-0033-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.008

2018-01-12

国家自然科学基金项目（31501923）；江苏省自然科学基金项目（BK20150443）；中国博士后基金项目（2015M581872）；江苏省博士后基金项目（1501073A）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；扬州大学大学生学术科技创新基金项目（x20160715、x20170766）

阚秋琪（1996-），女，本科在读，主要从事实验动物研究。E-mail：1057419142@qq.com。

邢华（1961-），男，教授，博士，主要从事人类疾病的动物模型方面的研究。E-mail：hxing@yzu.edu.cn。潘士锋（1984-），男，副教授，博士，主要从事动物生长调控方面的研究。E-mail：pan.sf@163.com。