磷酸化P38在神经病理性疼痛大鼠背根神经节中的作用机制

解丽丽，吕洪涛，许瑞雪

（1. 大连市中心医院神经内科，辽宁 大连 116033； 2. 大连医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 大连 116011）

丝裂素活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinase，MAPKs） 存在于细胞中，是在细胞信号转导通路中发挥重要作用的丝/苏氨酸蛋白激酶。P38蛋白是MAPKs家族中重要的一员，许多生理性与化学性刺激都能激活P38的磷酸化。JOHNSON等［1］研究发现，ERK、JNK、磷酸化P38（phosphorylated P38，p-P38）蛋白激酶所参与的细胞内信号转导通路在细胞增殖、分化、凋亡、神经元可塑性等多种生理病理过程中发挥重要作用。许力等［2］研究发现，脊髓中的P38与TNF-α活化，抑制P38磷酸化可以减少TNF-α，提示P38可能参与疼痛的中枢敏化。P38广泛存在于脊髓和背根神经节 （dorsal root ganglion，DRG） ，并在炎症反应中发挥着抗炎作用［3-4］。

慢性背根神经节压迫 （chronic compression of dorsal root ganglion，CCD） 模型是一种外周神经病理性疼痛模型，是研究外周神经不完全性损伤的常用动物模型，本研究检测CCD大鼠DRG中p-P38 表达情况，探讨p-P38在神经病理性疼痛大鼠DRG中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

18只SD大鼠 （160～180 g，雌性） 由大连医科大学附属第一医院动物实验中心提供。室温饲养，12 h照明/12 h黑暗，水与鼠粮自由食用。实验前大鼠要适应实验室环境1 h。动物使用遵照大连医科大学动物管理委员会要求。大鼠随机均分为3组：假手术组（sham组） 、CCD组、CCD模型SB203580给药组 （治疗组） ，每组6只。分别于术后14 d测完行为学取材。

1.2 试剂

P38抑制剂，4-（4-氟苯） -2-（4-甲磺酰苯） -5-（4-吡啶基） -1氢-咪唑 （SB203580，美国Sigma公司） ；内参β-actin抗体、p-P38抗体与P38抗体 （美国Cell Signaling公司） 。

1.3 CCD模型制备

大鼠腹腔注射l%戊巴比妥钠 （40 mg/kg） 麻醉后，用剃毛刀将腰背部的毛剃光，铺上纸巾暴露出手术野，沿着右侧脊椎从L2-5切开皮肤、分离肌肉。将“L型” （长3 mm、直径0.6 mm） 的不锈钢棒，与背部正中线成30°角，与脊柱侧面水平线成15°。分别插入L3和L4椎间孔，观察到大鼠右后肢抽动即为插入成功。术后腹腔注射青霉素预防感染。鞘内置管在CCD手术前实施，打开L6的硬脑膜，将导管置入大鼠的蛛网膜下腔，大约位于L3-4，缝合后固定导管，等待大鼠恢复24 h后再进行CCD手术。

1.4 大鼠机械疼痛阈值测试

检测大鼠后足对Von Frey丝 （直径200 μm） 刺激的缩足反应，使用机械缩足阈值 （paw withdrawal mechanical threshold，PWMT） 衡量机械疼痛的程度。大鼠放置在1个10 cm×10 cm×15 cm的透明玻璃盒中，底部放置金属网 （0.5 cm×0.5 cm） 。使用Von Frey丝垂直扎大鼠的足底，当大鼠后足突然扬足、缩足或舔足反应为阳性，每次刺激间隔10 min，每只大鼠重复测量5次，取平均值。

1.5 大鼠热痛阈值测试

通过检测大鼠后足底对热刺激产生的缩腿动作时间（ paw withdrawal thermal latency，PWTL） 来衡量热痛阈值。把待检测的大鼠单独放置于底部厚为0.22 mm的透明玻璃笼（ 20 cm×20 cm×40 cm） 中，在安静环境下适应30 min后，使用热辐射疼痛刺激器（ BME-410C，天津伯尔尼科技有限公司） 在玻璃板下固定距离聚焦大鼠后足底，当大鼠产生缩足或舔足停止照射，记录照射起止的间隔时间。每只大鼠重复测量5次，间隔时间＞5 min，取平均值作为PWTL。为避免给大鼠足底皮肤造成损伤，设置最高阈值为20 s。

1.6 Western blotting检测大鼠DRG神经元中p-P38的表达

所有蛋白取自实验大鼠L3和L4的DRG。每个样品总蛋白25 μg，使用10%的SDS-PAGE进行电泳，在4 ℃转膜1 h到PVDF上，使用TBST（ 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，0.15 mol/L NaCl，0.05% Tween-20） 冲洗，共洗3次，每次10 min；接着用含10%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h，然后用一抗p-P38抗体（ 1∶500） 4 ℃孵育过夜，第2天用TBST洗3次，每次10 min，之后应用二抗（ 1∶1 000） 室温孵育1 h，使用发光试剂盒（英国ECL kit公司） 检测发光信号。所有实验使用等量蛋白进行P38（ 1∶1 000） 和β-actin抗体（ 1∶2 000）检测。p-P38和P38的蛋白条带灰度值用Image J软件（美国NIH公司） 分析。

1.7 统计学分析

使用统计软件SPSS 12.0进行数据处理。实验数据用±s表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠机械疼痛行为学结果比较

大鼠机械疼痛行为学结果显示，大鼠在进行CCD手术前对机械刺激的缩腿反应的基础阈值是20.5 g。与sham组比较，CCD组大鼠的机械缩腿阈值明显降低 （P＜ 0.01） ，并表现为时间依赖性，手术后1、3、5、7 d后持续降低，但手术后14 d大鼠的机械缩腿阈值增加，恢复近正常。与CCD组比较，治疗组大鼠除第1天外，其他时间点的机械缩腿阈值明显升高 （P＜ 0.05） 。3组大鼠在手术后14 d，机械缩腿阈值都恢复至正常，没有统计学差异 （P＞ 0.05） 。见表1。

2.2 各组大鼠热疼痛行为学结果比较

表1 3组大鼠对机械刺激、热刺激所产生缩足反应比较Tab.1 Comparison of the withdrawal response to mechanical stimuli and heat stimuli in the three groups

热刺激反应结果显示，大鼠在进行CCD手术前对热刺激缩腿反射基础阈值是13 s。与sham组比较，CCD组、治疗组大鼠对热刺激的缩腿反射时间明显缩短 （均P＜ 0.01） 。鞘内注射SB203580不能改变CCD引起的热痛觉过敏，见表1。

2.3 各组大鼠DRG中p-P38的表达

Western blotting结果显示，sham组大鼠DRG仅有少量p-P38蛋白表达。与sham组比较，CCD组大鼠手术14 d后DRG中p-P38蛋白表达明显增加 （P＜0.01） 。与CCD组比较，治疗组大鼠手术14 d后DRG中p-P38蛋白表达明显减少 （P＜ 0.01） 。各组大鼠P38蛋白表达没有变化。见图1。

图1 各组大鼠DRG中p-P38和P38蛋白表达比较Fig.1 p-P38 and P38 protein expression levels in the DRG of rats

3 讨论

p-P38抑制剂是吡啶咪唑衍生物，主要有第一代SB202190、SB203580、SB220025，第二代SB239063等。其中，SB203580是可以通过细胞的分子，与ATP竞争性结合P38上的位点而发挥抑制作用。SB203580抑制P38磷酸化，减少脊髓中TNF-α合成，从而缓解神经病理性疼痛［2］。

本实验结果发现，CCD能引起大鼠对机械与温度刺激的痛觉异常。提前鞘内注射SB203580能够抑制机械刺激引起的痛觉异常，对热刺激引起的痛觉异常没有作用。PIAO等［6］研究发现，CCD引起三叉神经节损伤，激活胶质细胞与小胶质细胞中的p-P38，引起痛觉过敏。因此，SB203580可能在DRG的神经元细胞中具有相似功能，通过抑制P38的磷酸化来保护DRG中的神经元细胞，防止神经病理性疼痛的发生。

胡建雷等［7］报道，脊髓背角中P38磷酸化，能够引起CCD大鼠的神经病理性疼痛。韩光等［8］报道，高压氧可能通过活化脊髓中的P2X4受体，激活p38 MAPK信号通路，进而缓解CCI大鼠的机械痛与热痛。近年有学者［9-10］报道，MAPK信号通路中的P38在炎症细胞、应激、凋亡和神经病理性疼痛中发挥着重要作用。本研究结果显示，SB203580注射可以引起大鼠DRG中p-P38蛋白表达增加。P38只是MAPK信号通路中的作用蛋白，还需要对该信号通路的上下游进行深入研究，探讨其他蛋白的表达变化情况。SB203580有可能通过增加p-P38蛋白表达，从而调控下游信号通路，引起ERK-κ Bp65磷酸化，发挥缓解神经病理性疼痛的作用。

综上所述，SB203580能够减轻CCD所引起的机械痛，但对CCD所引起的热痛没有作用。p-P38蛋白可能是神经病理性疼痛的作用靶点，今后有可能指导临床用于缓解慢性疼痛。

参考文献：

［1］ JOHNSON GL，LAPADAT R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK，JNK，and p38 protein kinases ［J］. Science，2002，298 （5600） ：1911-1912. DOI：10.1126/science.1072682.

［2］ 许力，虞雪融，黄宇光.P38 MAPK抑制剂对神经病理性疼痛大鼠脊髓TNF-α合成的影响［J］.基础医学与临床，2012，32 （10） ：1126-1131.

［3］ BORDERS AS，DE ALMEIDA L，VAN ELDIK LJ，et al. The p38 alpha mitogen activated protein kinase as a central nervous system drug discovery target ［J］. BMC Neurosci，2008，9 （S2） ：S12. DOI：10.1186/147-2202-9-s2-s12.

［4］ KONDO T，SAKURAI J，MIWA H，et al. Activation of p38 MAPK through transient receptor potential A1 in a rat model of gastric distension induced visceral pain ［J］. Neuroreport，2013，24 （2） ：68-72.DOI：10.1097/WNR.0b013e32835c7df2.

［5］ HU SJ，XING JL. An experimental model for chronic compression of dorsal root ganglion produced by intervertebral foramen stenosis in the rat ［J］. Pain，1998，77 （1） ：15-23.

［6］ PIAO ZG，CHO IH，PARK CK，et al. Activation of glia and microglial p38 MAPK in medullary dorsal horn contributes to tactile hypersensitivity following trigeminal sensory nerve injury ［J］. Pain，2006，12（3） ：219-231. DOI：10.1016/j.pain.2005.12.023.

［7］ 胡建雷，申文，曾因明.脊髓p38MAPK在大鼠背根节慢性压迫神经病理性疼痛中的作用［J］.中国药理学通报，2008，24 （4） ：530-533.

［8］ 韩光，李璐，赵平.高压氧对神经病理性疼痛大鼠p38MAPK信号通路的影响［J］.中国医科大学学报，2016，45 （8） ：723-727.

［9］ 张涛，杨承祥，王汉兵.p38MAPK信号通路与疼痛的关系 ［J］.中国疼痛医学杂志，2012，18 （3） ：177-180.

［10］ 王依慰，李伟彦.P38促分裂原活化蛋白激酶在神经病理性疼痛中的作用 ［J］. 中国临床神经科学，2015，23 （4） ：454-458.