天然水蛭素对肌腱成纤维细胞抑制作用的体外研究

曾林如 汤样华 王楠

【摘要】 目的：通过体外实验研究天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞的抑制作用及三种相关细胞因子表达水平的变化，揭示天然水蛭素预防肌腱粘连的作用及相关途径。方法：体外分离培养兔肌腱成纤维细胞，采取MTT法检测不同浓度天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞增殖活性的影响；运用ELISA法测定兔肌腱成纤维细胞转化生长因子β1（TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达含量。结果：与未加水蛭素组（0 U/mL）比较，天然水蛭素干预组（1.50、3.00、6.00 U/mL）能够显著抑制兔肌腱成纤维细胞生长；并正向调节bFGF与MMP-2含量表达，负向调节TGF-β1含量表达（P<0.05或<0.01）。结论：天然水蛭素能够显著抑制体外培养的兔肌腱成纤维细胞的增殖，且具有一定的浓度依赖性；通过降低兔肌腱成纤维细胞TGF-β1的表达并相应提高bFGF与MMP-2的表达可能是其基于TGF-β1/Smads信号通路发挥抗纤维化作用的一种有效途径。

【关键词】 水蛭素； 成纤维细胞； 肌腱粘连； TGF-β1； bFGF； MMP-2

【Abstract】 Objective：To reveal the function and pathway of preventing tendon adhesion of hirudin，we investigate the anti-fibrosis effect of hirudin and the expression of three kinds of related cytokines in rabbit tendon fibroblasts in vitro.Method：Firstly，culturing rabbit tendon fibroblasts in vitro，and then observing the morphological changes of each group.Nextly，proliferative activity of fibroblasts was detected by MTT method in different concentrations of hirudin.Finally，the expression levels of transforming growth factor β1（TGF-β1），basic fibroblast growth factor（bFGF） and matrix metalloproteinase 2（MMP-2） in rabbit tendon fibroblasts were determinated by using the method of ELISA.Result：Hirudin intervention group（1.50，3.00，6.00 U/mL） could inhibit the growth of rabbit tendon fibroblasts compared with 0 U/mL group，and increase the expression of MMP-2 and bFGF，while decrease the expression of TGF-β1（P<0.05 or <0.01）.Conclusion：Hirudin can inhibit the proliferative activity of rabbit tendon fibroblasts with concentration dependent in vitro.By increasing the expression of bFGF and MMP-2 and reducing the expressing of TGF-β1 of rabbit tendon fibroblasts may be an effective pathway of anti-fibrosis in hirudin based on TGF-β1/Smads pathway.

【Key words】 Hirudin； Fibroblasts； Tendon adhesion； TGF-β1； bFGF； MMP-2

First-authors address：Xiaoshan TCM Hospital，Hangzhou 311201，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.003

肌腱粘連是外伤后较为常见的并发症，甚者会对关节功能有明显的影响，近年来已成为临床迫切需要解决的问题和研究焦点[1-2]。因此，在不影响肌腱本身愈合的同时，如何降低肌腱粘连发生率，已成为近年研究的焦点[3-5]。研究认为肌腱外源性愈合过程中成纤维细胞的过度增殖是造成肌腱粘连的主要原因[6-8]。其次，与成纤维细胞转化生长因子β1（TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）等细胞生长因子密切相关[9-11]。因此，通过抑制腱鞘中成纤维细胞的增殖及相关细胞因子的表达抑制损伤肌腱的外源性愈合以防治外伤后肌腱粘连，成为治疗的重要突破点。现代医学表明，水蛭素是从水蛭及其唾液腺中分离提取而得的一种小分子蛋白质（多肽），能有效抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖，减小凝血酶对内皮细胞的刺激[12-15]。另有研究发现水蛭素能通过促进bFGF的分泌，抑制TGF-β1分泌，达到抑制成纤维细胞的生长、增殖减轻瘢痕粘连的效果[16]。但至今仍未阐明水蛭素抑制肌腱粘连确切的作用机理和解决术后肌腱粘连的问题。因此，本实验通过探讨天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞因子表达的影响，旨在深入揭示天然水蛭素预防肌腱粘连的作用机制，为临床推广中药及中药制剂防治肌腱粘连提供理论依据，开辟新的思路及方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 普通成年新西兰大白兔5只，体重3～4 kg，由浙江中医药大学实验动物研究中心饲养。

1.1.2 主要试剂 天然水蛭素（广西科康生物科技有限责任公司）；胰酶、Ⅰ型胶原酶（Worthington公司）；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Amresco公司）；二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司）；TGF-β1、bFGF和MMP-2的ELISA检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 主要仪器 恒温CO2培养箱（CB150型，Binder分司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；电子天平（AB104-S型，Mettler Toledo公司）；电热恒温水浴槽（DK-600型，上海医疗器械五厂）；台式离心机（800型，上海手术器械厂）；全自动酶标仪（ELX800型，Bio-Tek公司）。

1.1.4 不同浓度天然水蛭素的配置 将天然水蛭素溶于含15%胎牛血清的DMEM培养液，配成浓度为100 U/mL的含天然水蛭素培养液，过滤除菌；以其为母液照倍比稀释法分别配制后续所需浓度天然水蛭素培养液。

1.2 实验方法

1.2.1 兔肌腱成纤维细胞的培养 普通级成年雌性新西兰兔5只（体重3～4 kg，由浙江中医药大学实验动物中心提供），用氯胺酮肌注麻醉，无菌切取前肢中趾趾深屈肌腱10条，采用组织块法进行原代培养。用0.05%洗必泰溶液浸泡5 min，生理盐水漂洗、反复3次，置于0.25%浓度胰酶、4 ℃冷消化处理18 h，然后转移至培养皿中进行DMEM清洗，并充分剪碎处理，加入0.25%浓度Ⅰ型胶原酶，37 ℃孵育1 h，吸管反复吹打组织块、分散细胞，消化液100目筛过滤处理，收集滤过的细胞悬液，1 000 r/min离心处理5 min，弃上清；用含15%胎牛血清的DMEM培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液；然后行细胞计数，调整至密度为2×105/mL的细胞悬液，接种于培养瓶，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。每2～3天换液一次；细胞融合至80%～90%时按常规方法接种，选用第4～5代细胞。

1.2.2 不同浓度天然水蛭素干预下对兔肌腱成纤维细胞增殖活性的抑制作用 这里需要说明的是水蛭素的单位U。本实验室是用凝血酶直接滴定法来测定。水蛭素的一个抗凝血酶活力单位U是指在37 ℃下，使一个单位的凝血酶失活所需水蛭素的量。实验按照水蛭素浓度分为11组：A组（对照组，0 U/mL），B组（1 U/mL），C组（2 U/mL），D组（3 U/mL），E组（4 U/mL），F组（5 U/mL），G组（6 U/mL），H组（7 U/mL），I组（8 U/mL），J组（9 U/mL），K组（10 U/mL），每組6孔。先每孔加入1×104个细胞，37 ℃、5%CO2条件下孵育12 h，细胞贴壁后吸弃培养液。对照组每孔加入无血清DMEM培养液600 μL，其他各组每孔加入含对应浓度的水蛭素DMEM培养液600 μL。继续培养48 h，然后每孔分别加入5 mg/mL的MTT溶液40 μL，培养4 h后吸去上清液，加入300 μL DMSO，振荡15 min，使紫色结晶物完全溶解。然后用酶标仪检测各孔490 nm波长处的吸光度值（OD值）。

1.2.3 不同浓度天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞TGF-β1、MMP-2以及bFGF表达水平的影响 采用双抗体夹心ELISA法分别检测每组标本TGF-β1、MMP-2和bFGF的表达含量，操作步骤严格依照试剂盒说明实施。用酶标仪在450 nm处测定样品OD值，根据OD值计算出样品的浓度。实验根据水蛭素浓度分为5组：0 U/mL组、0.75 U/mL组、1.50 U/mL组、3.00 U/mL组和6.00 U/mL组，每组6孔。每孔加入1×104个细胞，37 ℃、5%CO2条件下孵育12 h，细胞贴壁后吸弃培养液。对照组每孔加入无血清DMEM培养液100 μL，其他各组每孔加入含对应浓度的天然水蛭素DMEM培养液100 μL。培养48 h后，每孔各加入生物素化的TGF-β1抗体稀释液、MMP-2抗体稀释液以及bFGF抗体稀释液各100 μL，封板胶纸密封处理，培养1小时后洗板5次，最后1次置厚吸水纸上拍干。每孔加入辣氧根过氧化物酶（HRP）100 μL混匀，继续避光培养20 min后再次洗板拍干。每孔加入100 μL底物显色溶液（TMB），混匀后继续避光培养20 min。最后每孔加入50 μL终止液，混匀即刻应用酶标仪检测450 nm波长处各孔的OD值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用LSD检验，P<0.05为显著差异，P<0.01为明显显著差异。

2 结果

2.1 天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞有显著抑制作用 天然水蛭素浓度为6 U/mL（作用时间48 h）时对兔肌腱成纤维细胞的抑制率可达46.54%，并随着浓度的增加，作用显著增强，见图1。

2.2 不同浓度天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞TGF-β1的表达均具有抑制作用随着天然水蛭素浓度的增加，成纤维细胞中的TGF-β1的浓度呈下降趋势。天然水蛭素浓度为6.00 U/mL抑制作用最明显。当浓度为1.50、3.00、6.00 U/mL时，TGF-β1的浓度均明显低于0 U/mL组，差异均有统计学意义（P<0.05或<0.01），见图2和表1。

2.3 不同浓度天然水蛭素对兔肌腱成纤维细胞MMP-2和bFGF的表达均具有促进作用 随着天然水蛭素浓度的增加，成纤维细胞中的MMP-2和bFGF的浓度均呈现上升趋势。天然水蛭素浓度为6.00 U/mL时促进作用最明显。天然水蛭素浓度为1.50、3.00、6.00 U/mL时，MMP-2和bFGF的表达均明显高于0 U/mL组，比较差异均有统计学意义（P<0.05或<0.01），见图3和表2。