内镜下构建抗反流动物的实验研究

孙贤久 秦先锋 郭少卿 刘思纯 左海军 张莉

【摘要】 目的：探讨内镜下构建胃食管抗反流动物模型的可行性。方法：选取6～12月龄胃食管反流病的Beagle实验犬模型12只，分别在内镜下构建抗反流动物模型，另选10只正常犬作为对照，比较各组犬食管压力、食管pH和食管病理学检查情况。结果：12只胃食管反流病实验犬构建抗反流动物模型中，10例构建成功，1例构建失败，1例由于吻合口瘘死亡，成功率为83.3%；反流犬食管压力明显低于正常犬和抗反流犬，差异均有统计学意义（t=4.457、4.316，P<0.05），而抗反流犬与正常犬食管压力比较差异无统计学意义（t=0.691，P>0.05）；反流犬、抗反流犬和正常犬反流>5 min次数比较，差异无统计学意义（P>0.05），反流犬的反流次数和反流最长时间均明显高于正常犬和抗反流犬（t=5.094、5.515，P<0.05；t=4.028、4.846，P<0.05），而抗反流犬和正常犬相比差异均无统计学意义（t=1.361、1.845，P>0.05）；反流犬和抗反流犬的反流率均明显高于正常犬（t=8.416、4.337，P<0.05），反流犬的反流率也明显高于抗反流犬（t=5.217，P<0.05）；正常实验犬食管组织呈现明显的复层鳞状结构，上皮层内有少量炎症细胞存在，其他各层均正常；胃食管反流实验犬食管组织中上皮层存在明显的膨胀和增厚，黏膜层有大量的炎症细胞存在，此外部分肌层还存在断裂等情况；胃食管抗反流實验犬食管组织中上皮层有轻微膨胀或增厚，黏膜层有较多炎症细胞存在，未发现基层断裂现象。结论：采用本研究方法构建的抗反流动物抗反流效果显著，可用于抗反流动物构建的相关实验研究。

【关键词】 内镜； 胃食管反流； 抗反流

【Abstract】 Objective：To explore the feasibility of structuring gastroesophageal anti-reflux animal model with endoscope.Method：Twelve 6-12-month-old Beagle experiment dogs which have gastroesophageal reflux are separately structured gastroesophageal reflux animal model with endoscope.Ten more normal dogs were selected as comparison which includes esophageal pressure，esophagus pH and histopathological observation of esophagus.Result：In 12 dogs with gastroesophageal reflux，10 dogs were successfully structured and 1 dog was failed，1 dog died of anastomotic fistula，the success rate was 83.3%.The esophageal pressure of reflux dogs was significantly lower than those of normal dogs and anti reflux dogs，the differences were statistically significant（t=4.457，4.316，P<0.05），while the esophageal pressure of anti reflux dogs and normal dogs had no significant difference（t=0.691，P>0.05）.There was no significant difference in the times of reflux more than 5 min among three dogs（P>0.05）.Reflux times and the longest time of reflux of reflux dogs were significantly higher than those of normal dogs and anti reflux dogs （t=5.094，5.515，P<0.05；t=4.028，4.846，P<0.05），while anti reflux dogs and normal dogs had no statistical difference（t=1.361，1.845，P>0.05）.The reflux rate of anti reflux dogs and anti reflux dogs were significantly higher than those of normal dogs（t=8.416，4.337，P<0.05），the reflux rate of reflux dogs was significantly higher than that of anti reflux dogs（t=5.217，P<0.05）.The esophageal tissue of normal experiment dog showed a significant layer of squamous structure.Small amount of inflammatory cells existed in the epithelium.Other layers showed normal.The middle and up dermic layer of experiment dogs appeared significant expansion and thickening.Plenty of inflammatory cells existed in mucosal layer.In addition，partial muscular layers showed rupture and so on.The middle and up dermic layer of anti-reflux dogs esophageal tissue had a slight expansion or thickening.There were more inflammatory cells and no grassroots fracture was found.Conclusion：The anti-reflux effect of anti-reflux animal model structure which adopts present research method is remarkable. It can be applied into relevant experiment and study of anti-reflux animal model structure.

【Key words】 Endoscopy； Gastroesophageal reflux； Anti-reflux

First-authors address：Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University，Dongguan 523110，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.005

胃食管反流（Gastroesophageal reflux disease，GERD）主要是指由于各种因素造成十二指肠或胃的内容物返回到食管中进而引发的并发症或症状[1]。临床上GERD患者中轻者会表现出恶心、发酸、胃灼热等症状，重者甚至会发生出血、糜烂和食管狭窄等症状，会严重影响患者的生活质量[2]。从目前来看GERD的临床治疗方法有许多，虽然常规的药物治疗和外科治疗具有一定的效果，但也存在其较为明显的缺陷，近年来我国微创技术得到了长足的发展，由于微创技术在临床治疗中表现出的明显优势，使其在各科室得到了广泛应用[3]。目前关于GERD的内镜治疗是近年来国内外的研究热点，但其安全性及疗效仍需大量的动物实验或临床实验证实。而制备合适的胃食管反流并动物模型对于实验研究的准确性至关重要[4-5]。目前关于胃食管反流的内镜治疗是近年来国内外的一个研究热点[6]，但其安全性及疗效仍需大量的动物实验或临床实验证实，而制备合适的动物实验模型对于研究的准确性至关重要[7]。笔者另一篇研究中有报道关于胃食管反流动物模型的构建方法，本研究中提出了一种内镜下构建胃食管抗反流动物模型的方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取6～12月龄胃食管反流病的Beagle实验犬模型12只，其中雌犬和雄犬各6只，体质量10～12 kg，另选10只正常犬作为对照，正常犬与实验犬性别、体质量等方面比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。试剂仪器：速眠新Ⅱ号，福尔马林溶液，0.5%～1%伊红酒精溶液，苏木精染液，1%盐酸酒精分化液，肾上腺素，靛胭脂，多导肠胃功能测定仪，pH动态检測记录仪，光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 胃食管反流病动物模型的构建 （1）术前准备：实验犬在术前禁食禁水1 d，以0.1～0.15 mg/kg的速眠新Ⅱ号对实验犬进行静脉全麻，无须进行气管插管，使所有实验犬可以进行自主呼吸，若实验犬在麻醉后仍然存在躁动等状态，应适当增加麻醉药的使用剂量。在内镜下测量门齿到贲门之间的距离，在胃和食管交界处的上端7～10 cm处切开黏膜层，并在右后壁黏膜处注射肾上腺素和靛胭脂，采用Hook刀将黏膜层切开1～3 cm的开口，暴露黏膜的下层组织，并进行相关的分离操作。（2）食管黏膜下隧道的建立：食管黏膜下隧道建立的核心原则是与食管环形肌层保持垂直的角度，确保黏膜隧道始终处于直线型。（3）切开环形肌：在胃镜下采用Hook刀在GEJ上端7～9 cm处切入，从上到下垂直切至GEJ下段1～3 cm处，暴露纵行肌，再采用Hook刀从环形肌和纵行肌的空隙中伸入，切入环形肌，在胃镜的引导下，逐步将整个环形肌切开。

1.2.2 胃食管抗反流动物模型的构建 首先在胃镜下固定胃窦体前壁和腹壁，在“三角形”范围内取两个点，采用穿刺针刺入到实验犬胃腔内，将针芯取出，将内镜通过鞘管插入，然后在内镜引导下将针持送入胃腔，并进一步将缝线和缝针送到贲门和胃底的交界之处[8]。“U”型反转胃镜，并在其引导下采用组织钻钻入到胃底和贲门交界之处的黏膜，然后向后拉黏膜，使其形成黏膜瓣，长度以5cm左右为宜，最后采用缝针和缝线将黏膜瓣进行内缝合并结扎，使其形成向胃腔内突起的黏膜嵴，对侧采用相同的方法也制成黏膜嵴。手术结束后实验犬食管有一定程度的延长，贲门环则会紧缩，胃食管的交界处会有抗反流瓣形成，同时食管胃底的成角会明显加大，从而共同形成了抗反流屏障[9-10]。通过摸索，最适合的技术指标如下：抗反流瓣长度约2 cm，高度约1.5 cm，抗反流瓣形成后胃食管交界处的开放直径约为1.0 cm[11-14]。

1.3 观察指标

1.3.1 食管压力测定 采用多导肠胃功能测定仪分别测定正常犬、胃食管反流实验犬和抗反流实验犬的食管压力。具体测定方法如下：采用多导胃肠功能测定仪，使用高分辨四道毛细灌注测压系统，以犬胃内正常的压力作为基准线，测定其食管压力。

1.3.2 食管pH测定 采用pH动态检测记录仪分别检测正常犬、胃食管反流实验犬和抗反流实验犬的食管pH值。采集食管酸反流（pH值<4）次数，长时间酸反流（pH值<4持续5 min以上）次数，最长反流时间（pH值<4持续的最长时间）以及酸反流率等指标。

1.3.3 病理学检查 取实验犬食管组织，采用福尔马林固定，再用石蜡进行包埋，将包裹后的组织切片（厚度约4 μm），在60～70 ℃烘箱中干燥2 h，然后经苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察其食管组织变化情况。

1.4 统计学处理 采用Epidata 3.0对本研究数据进行录入校对，SPSS 19.0进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗反流动物构建情况 12只胃食管反流病实验犬构建抗反流动物模型中，10例构建成功，1例构建失败，1例由于吻合口瘘死亡，成功率为83.3%。在成功建模的10只反流犬的基础上建立抗反流犬。

2.2 食管压力情况 反流犬食管压力为

（1.32±0.19）kPa，明显低于正常犬的（2.33±0.35）kPa和抗反流犬的（2.13±0.24） kPa，差异均有统计学意义（t=4.457、4.316，P<0.05），而抗反流犬与正常犬食管压力比较，差异无统计学意义（t=0.691，P>0.05）。

2.3 食管pH情况 反流犬、抗反流犬和正常犬反流>5 min次數比较，差异无统计学意义（P>0.05），反流犬的反流次数和反流最长时间均明显高于正常犬和抗反流犬（t=5.094、5.515，P<0.05；t=4.028、4.846，P<0.05），而抗反流犬和正常犬相比差异无统计学意义（t=1.361、1.845，P>0.05）；反流犬和抗反流犬的反流率均明显高于正常犬（t=8.416、4.337，P<0.05），反流犬的反流率也明显高于抗反流犬（t=5.217，P<0.05）。见表1。

2.4 病理学检查情况 正常实验犬食管组织呈现明显的复层鳞状结构，上皮层内有少量炎症细胞存在，其他各层均正常；胃食管反流实验犬食管组织中上皮层存在明显的膨胀和增厚，黏膜层有大量的炎症细胞存在，此外部分肌层还存在断裂等情况；胃食管抗反流实验犬食管组织中上皮层有轻微膨胀或增厚，黏膜层有较多炎症细胞存在，未发现基层断裂现象。

3 讨论

近年来，虽然我国人民生活水平得到了显著改善，但是不规律的饮食习惯导致各类消化道疾病发生率大幅升高[15]，而胃食管反流病是一种常见的消化道疾病，目前临床上虽然有许多治疗方法，主要可以分为内科治疗（药物治疗）和外科治疗，但是内科治疗通常无法根治，患者需要长期服药，且易复发因此临床上多用于轻度胃食管反流患者的治疗；外科治疗虽然效果显著，但是对患者创伤较大，易引起各类手术并发症，导致手术预后效果较差。鉴于内科治疗和外科治疗对于胃食管反流病的治疗效果欠佳，近年来开始有国外学者研究将微创技术应用于胃食管反流病的治疗中，其相比内科治疗和外科治疗等方法具有显著的优势[16]，但其安全性及疗效仍需大量的动物实验或临床实验证实，而制备合适的动物实验模型对于研究的准确性至关重要。笔者在另一篇研究报道中提到目前制备胃食管反流病动物模型的方法可以分为两类，即手术法和非手术法，其中手术法又可分为破坏食管下括约肌法、十二指肠或幽门结扎法、空肠或十二指肠吻合术法[17]。空肠或十二指肠吻合术法由于完全改变了实验动物的消化道解剖结构，因此通常不能用于疗效评价试验，因此应用相对较少；十二指肠或幽门结扎法制备的食管反流病动物模型通常存活期较短，多用于短期动物实验研究，但无法满足中长期动物实验研究需求[18]；破坏食管下括约肌法虽然对实验动物的造成的创伤较大，实验动物具有较高的死亡率，但是其建模成功率较高，是目前应用最广泛的制备胃食管反流病动物模型的方法。非手术方法主要是指通过食管关注胃蛋白酶或酸制备简单的食管反流模型，但该法制备的食管反流模型通常仅适用于食管黏膜的损害、防御机制研究[19]。对此，笔者提出了一种内镜下环形肌切开术制备胃食管反流病动物模型的方法，从研究结果来看12只行内镜下环形肌切开术的实验犬，无死亡，全部存活，其中8只术后出现反流，另外4只术后未出现反流，建模成功率为66.7%。制备前实验犬食管压力明显大于制备后，差异有统计学意义（t=4.112，P<0.05）。制备后的实验犬反流次数、反流最长时间和反流率均大于制备前，差异均有统计学意义（t=3.968、4.037、4.006，P<0.05），但反流>5 min的次数制备前与制备后比较差异无统计学意义（t=1.651，P>0.05）。从病理学检查情况来看，制备前的正常实验犬食管组织呈现明显的复层鳞状结构，上皮层内有少量炎症细胞存在，其他各层均正常。而制备后的实验犬的食管组织中上皮层存在明显的膨胀和增厚，黏膜层有大量的炎症细胞存在，此外部分肌层还存在断裂等情况。这表明内镜下环形肌切开术是一种简单可靠的制备胃食管反流病动物模型的方法，该法制备胃食管反流病动物模型具有成功率高，不影响实验动物解剖结构，与胃食管反流发病机制吻合等特点，可用于评价胃食管反流的内镜治疗或手术治疗的疗效观察。

基于上述胃食管反流动物模型的构建研究，本文中提出了一种内镜下构建抗反流动物模型的方法，即通过“隧道式”消化内镜构建抗反流屏障。为了探讨该方法的可行性笔者选取了6～12月龄胃食管反流病的Beagle实验犬模型12只，分别在内镜下构建抗反流动物模型，另选10只正常犬作为对照，结果表明12只胃食管反流病实验犬构建抗反流动物模型中，10例构建成功，1例构建失败，1例由于吻合口瘘死亡，成功率为83.3%；胃食管反流犬食管压力明显低于正常犬和抗反流犬，差异均有统计学意义（t=4.457、4.316，P<0.05），而抗反流犬与正常犬食管压力比较差异无统计学意义（t=0.691，P>0.05）；胃食管反流犬、抗反流犬和正常犬反流>5 min次数比较，差异无统计学意义（P>0.05），反流犬的反流次数和反流最长时间均明显高于正常犬和抗反流犬（t=5.094、5.515，P<0.05；t=4.028、4.846，P<0.05），而抗反流犬和正常犬相比差异无统计学意义（t=1.361、1.845，P>0.05）；反流犬和抗反流犬的反流率均明显高于正常犬（t=8.416、4.337，P<0.05），反流犬的反流率也明显高于抗反流犬（t=5.217，P<0.05）；正常实验犬食管组织呈现明显的复层鳞状结构，上皮层内有少量炎症细胞存在，其他各层均正常；胃食管反流实验犬食管组织中上皮层存在明显的膨胀和增厚，黏膜层有大量的炎症细胞存在，此外部分肌层还存在断裂等情况；胃食管抗反流实验犬食管组织中上皮层有轻微膨胀或增厚，黏膜层有较多炎症细胞存在，未发现基层断裂现象。

综上所述，采用本研究方法构建的抗反流动物抗反流效果显著，对于临床上探讨有效治疗胃食管反流病的方法至关重要。

参考文献

[1]孙贤久，秦先锋，郭少卿，等.消化内镜手术构建食管抗返流屏障治疗犬胃食管返流病效果观察[J].海南医学，2017，28（5）：693-695.

[2]孙贤久，秦先锋，郭少卿，等.速眠新复合麻醉在实验动物内镜治疗中的麻醉效果分析[J].齐齐哈尔医学院学报，2016，37（35）：4361-4363.

[3]王强，王斌，張伟，等.导尿管球囊扩张法构建胃食管反流病动物模型方法的改进[J/OL].中华胃食管反流病电子杂志，2015，2（4）：230-232.

[4] Terzioglu T，Yalti T，Tezelman S，et al.Gastroesophageal reflux and a comparison of the different antireflux procedures following esophagomyotomy：an experimental study in rabbits[J].Surgery today，1998，28（8）：816-821.

[5]皮尔地瓦斯，克力木，艾克拜尔，等.腹腔镜抗反流手术联合胃大弯侧折叠术动物训练模型的建立[J].中华胃食管反流病电子杂志，2016，3（2）：49-52.

[6]葛建超，王云，谭佳成，等.内镜技术在治疗胃食管反流病中的研究进展[J].胃肠病学，2014，19（12）：753-756.

[7]马坦坦.不同级别反流性食管炎与食管动力异常之间关系的研究[D].长春：吉林大学，2013.

[8]胡海清，柴宁莉，令狐恩强，等.经口内镜下贲门缩窄术治疗胃食管反流病的临床研究[J/OL].中华胃肠内镜电子杂志，2016，3（2）：65-67.

[9]胡志伟，汪忠镐，纪涛，等.腹腔镜胃底折叠与食管扩张术治疗儿童胃食管反流病致消化性食管狭窄[J].临床误诊误治，2015，28（7）：74-76.

[10]王小晓，魏明，段飞，等.奥瑞凝胶抗反流性食管炎模型大鼠食管黏膜损伤的实验研究[J].中药新药与临床药理，2010，21（1）：1-3.

[11]艾克拜尔·艾力，克力木·阿不都热依木，张成，等.腹腔镜胃底折叠抗反流术联合胃袖状切除术动物实验研究[J].中国实用外科杂志，2015，35（2）：211-213.

[12]胡志伟，吴继敏，汪忠镐.胃食管喉气管综合征的再认识和胃镜下射频术治疗胃食管反流病的进展[J].中国微创外科杂志，2015，15（6）：558-562.

[13]鞠春慧，吴学东，李庄，等.套叠瓣在重建胆道中抗反流作用机制研究[J].中国普通外科杂志，2012，21（2）：169-172.

[14]杜植鹏，王斌，张伟，等.电刺激抗胃食管反流的作用及其相关神经通路的初步探讨[J].胃肠病学，2016，21（2）：80-84.

[15]张亚肖.反流性食管炎和抗胃食管反流手术动物模型的建立与实验研究[D].石家庄：河北医科大学，2006.

[16] Streitz J M，Ellis F H，Williamson W A，et al.Objective assessment of gastroesophageal reflux after short esophagomyotomy for achalasia with the use of manometry and pH monitoring[J].The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery，1996，111（1）：107-113.

[17]王玉芬，刘冀，李容.耐信联合黛力新治疗老年伴抑郁非糜烂性胃食管反流病的疗效及对生活质量的影响[J].世界华人消化杂志，2015，23（5）：777-781.

[18]潘殿柱.TRPV1在胃食管反流豚鼠模型气道神经源性炎症中作用的研究[D].沈阳：中国医科大学，2013.

[19]黄绍亮，黄明.老年人胃食管反流病72例诊治体会[J].中国医学创新，2012，9（7）：135-136.