维生素D对复发性流产患者外周血自然杀伤细胞的调节作用

徐士儒，王云霞，连若纯，张諝，陈伟洪，何来宾，陈婉如，陈现*

(1.深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳　518045；2.深圳市福田区妇幼保健院妇产科，深圳　518045)

复发性流产(recurrent miscarriage，RM)是指孕20周前连续发生3次或3次以上的自然流产，在育龄妇女中发病率为1%～3%[1]。研究表明，引起RM的病因主要包括遗传、内分泌和解剖结构异常、生殖道感染等，另外还有约40%～50%的患者病因不明[1]。免疫因素在RM的发生过程中可能起着重要的作用。正常妊娠的维持需要母体对胎儿产生免疫耐受，而免疫因素引起的RM可能是免疫耐受机制被破坏的结果。自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)在妊娠免疫机制中起着重要的调节作用，与RM中母胎免疫紊乱机制相关。周围血CD3-CD56+NK细胞的比例及NK细胞毒性增加可能与RM患者的不良妊娠结局有关[2-3]。近年来研究发现维生素D对免疫系统有着重要的调节作用。特别是活性1，25(OH)2D，可抑制T淋巴细胞的增值和分化[4]，能够促进Th1向Th2型免疫反应的转变[5]，以及能够抑制B细胞的增殖、浆细胞的分化和IgG抗体的分泌[6]。上述研究表明维生素D是一重要的免疫调节因子，维生素D缺乏可能参与了某些免疫因素介导的疾病发生。目前维生素D水平如何影响RM患者外周血NK细胞的数量和毒性尚不明确。本研究旨在探究RM患者血清中维生素D水平与外周血NK细胞数量和毒性的关系，以期为寻找RM的病因和临床治疗策略提供新的方向。

材料与方法

一、研究对象

选取2014年1月至2016年3月首次来本院治疗的99例的不明原因复发性流产(unexplained recurrent miscarriage，uRM)患者为研究对象。所有患者均经过详细询问病史、全身及妇科检查、染色体核型分析、宫腔感染和宫腔镜以及内分泌等系统性检查，入选标准为：(1)抗磷脂抗体(如抗β2糖蛋白1抗体、抗心磷脂抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体等)、抗核抗体(抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗Sm抗体等)和抗甲状腺抗体检测为阴性；(2)夫妇双方染色体及胚胎染色体核型分析正常；(3)女方无生殖道感染和生殖道畸形；(4)内分泌激素水平正常；(5)未有药物治疗或维生素D补充史。所有患者均在黄体中期首次抽取外周血，并于当天分别检测维生素D水平，NK细胞比例和NK细胞毒性。

根据内分泌协会临床实践指南，维生素D缺乏为25(OH)D水平<20 ng/ml，维生素D不足为25(OH)D在20～29.9 ng/ml之间，维生素D充足为25(OH)D≥30 ng/ml[7]。因此，本研究的99例RM患者根据其血清中25(OH)D水平被分为三组，即维生素D正常(vitamin D normal group，VDN)组35例、维生素D不足(vitamin D insufficiency group，VDI)组51例和维生素D缺乏(vitamin D deficiency group，VDD)组13例。维生素D不足和缺乏的患者每天口服0.5 μg的1，25(OH)2D(罗盖全，上海罗氏制药有限公司)，时长2个月。64例患者中，1例患者失访，3例拒绝1，25(OH)2D治疗，23例患者在维生素D补充过程中联合了其它治疗(如淋巴细胞治疗)。仅有37例患者为单纯1，25(OH)2D治疗，其中有2例来自VDD组。考虑到VDD组的样本过少，因此将维生素D不足和缺乏的患者混合为一组。1，25(OH)2D治疗后，再次抽取患者黄体中期的周围血，并检测其NK细胞比例和细胞毒性。本研究入选患者均签署检测项目和治疗知情同意书，实验流程获得医院学术与伦理学委员会许可。

二、实验设备和试剂

1.实验设备：ARCHITECT PLUS isR 2000自动化检测系统(Abbott，美国)，BD FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)。

2.主要实验试剂：ARCHITECT 25-OH Vitamin D Reagent Kit(Abbott，美国)，BD Multitest 6-color TBNK Reagent Kit(Becton Dickinson，美国)，BD FACS裂解液(Becton Dickinson，美国)，K562细胞株(购自武汉大学保藏中心)，碘化丙啶(PI，Sigma，美国)，10-壬基溴代吖啶橙染料(DIO，Invitrogen，美国)，淋巴细胞分离液(Axis-Shield，挪威)，RPMI 1640培养基(Invitrogen，美国)，新生牛血清(杭州四季青公司，中国)。

三、方法

1.维生素D水平检测：血清中25(OH)D水平的检测采用化学发光微粒子免疫方法，所有步骤根据试剂盒说明书完成。

2.外周血NK细胞数量检测：采用免疫荧光流式细胞技术检测。逆向加样法加入肝素抗凝血100 μl于Trucount管(Becton Dickinson，美国)中，再分别加入CD45-PerCP、CD3-FITC和CD16/CD56-PE抗体，室温避光标记15 min，加入经10倍稀释的BD FACS裂解液 2 ml，振匀，室温避光10 min，样本充分溶血后用PBS洗涤2次，流式细胞仪进行检测，并用FACSDiva软件进行数据获取和分析，计数CD3-CD16+CD56+NK细胞的比例。

3.NK细胞毒性检测[8]：抽取患者肝素抗凝血15 ml，用Ficoll密度梯度法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)，充分洗涤后，用完全培养基调整细胞浓度为1 × 107/ml备用；同时收集对数生长期的K562细胞(NK细胞敏感的靶细胞)，加入PBS缓冲液10～20 ml重悬细胞，室温离心，并进行细胞计数调整细胞浓度为1×106/ml；按细胞数1×106/ml加入3 mmol/L DIO染料，37℃孵育20 min；染色结束后，将K562细胞悬液用培养液洗涤2次；弃上清，通过细胞计数用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml备用；将处理好的PBMCs及K562细胞分别以50∶1、25∶1和12.5∶1的比例混合培养在96孔培养板中，每个比例设3个重复，每孔用培养液补足至200 μl；置于37℃，5% CO2培养箱混合培养4 h；4 h后，在混合培养孔中加入PI对死亡的K562细胞进行染色，流式细胞仪检测，FACSDiva软件进行数据分析。

四、统计学方法

所有统计分析均采用SPSS 16.0统计软件进行。治疗前各组NK细胞比例和NK细胞毒性采用单因素方差分析；治疗前后NK细胞比例和NK细胞毒性变化采用配对t检验分析，以P<0.05为有统计学差异。

结　　果

一、RM患者一般资料及维生素D 水平

99例RM患者中，35例(35.4%)患者维生素D水平正常(≥30 ng/ml)，51例患者(51.5%)维生素D不足(20～29.9 ng/ml)，13例(13.1%)为患者维生素D缺乏(<20 ng/ml)。

RM患者的流产次数和维生素D水平在三组间具有显著差异，而三组间的年龄、体重指数(BMI)无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1　RM患者的基线资料及维生素D水平(-±s)

注：与VDN组相比，*P<0.05；与VDI组相比，#P<0.05

二、外周血NK细胞数量和NK细胞毒性

外周血中CD3-CD56+NK细胞比例在三组间无明显差异(P>0.05)。三组间的NK细胞毒性情况：与VDN组相比，效靶比(effector-to-target ratio，E∶T)为50∶1、25∶1和12.5∶1的NK细胞毒性在VDI中显著增加(P<0.05)。而且，E∶T为25∶1和12.5∶1的情况下，NK细胞毒性在VDD和VDN两组中有显著差异(P<0.05)。然而，在E∶T为50∶1的情况下，VDI和VDD两组的NK细胞毒性无显著差异(P>0.05)(图1，表2)。

A：三组CD3-CD56+ NK细胞的比例分析；B、C、D：三组效靶比为50∶1、25∶1和12.5∶1的NK细胞毒性，相互比较，*P<0.05图1　RM患者外周血NK细胞数量和NK毒性的比较

三、1，25(OH)2D补充对外周血NK细胞数量和细胞毒性的影响

低维生素D水平的RM患者经维生素D治疗后，CD3-CD56+NK细胞比例与治疗前相比无显著差异(P>0.05)。NK细胞毒性在三个E：T条件下均显著降低(P<0.05)(图2，表3)。

A：治疗前后CD3-CD56+ NK细胞的比例分析；B、C、D：治疗前后效靶比为50∶1、25∶1和12.5∶1的NK细胞毒性，**P<0.01图2　1，25(OH)2D对RM患者外周血NK细胞数量和NK毒性的影响

组别例数CD3-CD56+NK细胞(%)效靶比(E∶T)50∶125∶112 5∶1VDN3515 7±5 345 3±12 435 8±11 823 0±10 6VDI5117 1±7 051 6±8 8∗43 2±9 1∗30 2±10 3∗VDD1316 4±7 152 3±12 1∗45 4±11 9∗#32 8±11 0∗#

注：与VDN组相比，*P<0.05；与VDI组相比，#P<0.05

表3　1，25(OH)2D对RM患者外周血NK细胞数量和NK毒性的影响(n=37，-±s)

注：与治疗前相比，*P<0.05

讨　　论

生殖免疫学观点认为，妊娠是一种成功的同种异体移植，认为RM的发生是同种异体移植失败。成功妊娠依赖于母体对胎儿产生正确的识别和免疫耐受。NK细胞为异质性细胞群体，根据其表面CD56分子的表达水平主要分为CD56dimCD16+和CD56brightCD16-NK两个细胞亚群，CD56dimCD16+NK细胞具有较强的杀伤功能，能够诱导NK细胞的抗体依赖细胞毒性反应(ADCC)，对同种异体抗原具有杀伤作用，可在绒毛间隙中直接与绒毛接触杀伤胚胎[9]。CD56brightCD16-NK细胞主要功能是分泌细胞因子如干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)-β等，杀伤功能较弱。由此可见，NK细胞在妊娠的建立和维持以及胎盘的发育过程中同样发挥着重要作用。文献报道，RM患者外周血中NK细胞比例和毒性均显著增加[3]，认为NK细胞数量的增加是导致RM的一个重要因素[10]。与非妊娠女性比较，早期妊娠的女性其外周血中NK细胞活性显著降低[3]。这些结果均表明NK细胞比例和毒性的降低可能能够抑制母体对胎儿的同种免疫反应。

维生素D是维持人体生命所必需的营养物质，机体所需的大部分维生素D可在日光照射下由皮肤内的7-脱氢胆固醇转变而来，同时也可以从富含维生素D的食物中获得。由皮肤生成的和食物来源的维生素D在肝脏中经25羟基化酶的催化作用首先生成25(OH)D，血清25(OH)D是血液循环中维生素D的主要存在形式，常作为评价体内维生素D营养状况的指标。随后，25(OH)D在肾脏1a羟基化酶的作用下转换为具有活性的1，25(OH)2D，从而促进肠道钙离子的吸收以及骨代谢[7]。长期以来，人们对维生素D的认识主要集中在对骨代谢的调节。自1980年，人们发现维生素D受体在多种免疫细胞上表达后，越来越多的研究发现维生素D对免疫系统有着重要的调节作用，与多种疾病的发病机制密切相关[11-12]。

近年来越来越多证据表明维生素D缺乏或不足与妇产科妊娠并发症有关[13]。本研究数据表明在RM患者中维生素D缺乏或不足的比例较高，维生素D缺乏或不足的RM患者外周血NK细胞毒性显著增加。本研究结果与Ota等[14]报道一致，认为维生素D可参与调节RM患者的NK细胞毒性；他们还发现，维生素D对RM患者NK细胞数量也有显著的调节作用。然而，本研究结果表明，与维生素D正常水平的RM患者比较，维生素D缺乏或不足的患者CD3-CD56+NK细胞的比例并没有显著变化。这些结果均表明维生素D可能对RM患者外周血NK细胞毒性起着重要的调节作用。因此，推测维生素D对NK细胞数量和细胞毒性的影响是相互独立的。维生素D对NK细胞毒性的影响可能与穿孔素和颗粒酶的分泌有关，而与NK细胞数量无关[14]。由此可见，充足的维生素D水平在调控RM患者外周血NK细胞活性过程中可能发挥着关键作用。

本研究结果尚表明维生素D的补充对RM患者以上这些异常的细胞免疫反应具有一定的调节作用，RM患者经过1，25(OH)2D治疗后，其外周血所有效靶比条件下的NK细胞毒性均显著降低。本研究结果与早期的研究结果一致[6，15-17]。根据最近的文献报道，维生素D能够促进胞浆中去极化的穿孔素的表达，从而降调RM患者的NK细胞毒性[12]。但是，目前为止1，25(OH)2D对NK细胞的免疫调节机制仍不清楚。

综上所述，在RM患者中维生素D缺乏或不足具有一定的免疫学意义。低水平RM患者其外周血NK细胞毒性可能异常增加，而补充1，25(OH)2D后可显著降调NK细胞毒性。因此，对具有NK细胞毒性异常增加的RM患者，补充维生素D可作为一种新的辅助治疗方案。

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