Lactobacillus plantarum-12菌株胞外多糖培养条件优化及功能特性研究

刘雯雯，孙梦莹，刘丽娜，刘婷，妥彦峰

（大连工业大学食品科学与工程学院，辽宁大连116034）

乳杆菌属（Lactobacillus）细菌拥有悠久的人类食用历史，在发酵蔬菜、发酵乳制品、发酵肉制品加工方面起着重要的作用。乳杆菌属细菌利用食品物料中营养物质代谢产生的有机酸、双乙酰、胞外多糖可以改善发酵食品的风味、提高发酵食品的营养价值、改善发酵食品的质地结构，而乳杆菌胞外多糖在其中起到了重要的作用。胞外多糖是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物[1]。

自1982年日本Shino mi等报道乳酸菌胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）具有抗肿瘤作用以来[2]，越来越多的人着手研究乳酸菌EPS的功能特性。有体外实验研究发现Lactobacillus helveticus var.jugurti[3]、L.casei 01[4]作用结肠癌细胞HT-29，可以抑制其增殖。HarounL等研究发现L.plantarum NRRL B-4496的EPS对5种源癌细胞喉癌细胞、肠道癌细胞、Caco-2、肝癌细胞和宫颈癌细胞具有明显的抑制效果[5]。也有动物实验研究发现从开菲尔菌株中得到的EPS经小鼠口服后对肿瘤生长具有抑制作用[6]，Bifidobacterium bifidum的EPS对大鼠荷肝肿瘤亦有明显抑瘤效果[7]。

某些乳杆菌的EPS具有抗氧化的作用[8]，而引起氧化的主要原因是大量活性氧的产生，因此，乳杆菌EPS的抗氧化作用主要是通过清除氧自由基作为指标进行检测。乳酸菌胞外多糖抗氧化作用的原理依然还有待探讨，一般都是通过以下方式[9]：一是直接清除自由基本身，二是多糖分子会结合金属离子进而降低反应的速率，减慢有害物质的产生，抑制了自由基产生的速率，三是多糖分子可以间接提高抗氧化酶系的活力，加速了其他酶系的抗氧化作用[10]。

乳酸菌EPS具有广阔的应用前景，但产量通常较低是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。优化发酵条件是提高乳酸菌胞外多糖产量的重要途径[11]。乳杆菌胞外多糖的产量受很多因素的影响，除与菌种的遗传特性（控制多糖基因产生的酶系种类和活性）有关[12]，菌株培养基的营养成分和环境条件也会影响乳酸菌EPS的合成，且在不同营养条件和培养条件下合成的EPS的种类也不同[13]。研究表明，培养基成分主要包括碳源、氮源、碳氮比、金属离子及无机盐等[14]，环境条件包括培养基初始pH值、接种量、发酵温度和时间等，通过优化这些发酵条件均能显著提高EPS的产量[15]。当今社会人们越来越注重健康的生活方式，而胞外多糖的功效正符合这一社会需求。

本试验以大连工业大学大连益生菌功能特性重点实验室保存的L.plantarum-12乳杆菌菌株为研究对象，通过优化碳源、发酵温度和培养时间来提高胞外多糖产量，在此基础上对胞外多糖影响人结肠癌细胞HT-29增殖和清除DPPH自由基这两项功能特性进行研究。

1　材料与方法

1.1　材料与设备

1.1.1　材料

组织细胞：本试验所用人结肠癌腺细胞HT-29购自中国科学院上海典藏细胞库。

试验菌株：本试验所采用的菌株Lactobacillus plantarum-12为大连工业大学大连市益生菌功能研究重点实验室所保藏菌株，分离自多宝鱼肠道。

1.1.2　试剂

MTS试剂：普洛麦格（北京）生物技术有限公司；RPM1640培养液、青霉素和链霉素：美国Gibco公司；Tunel凋亡原位检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3　设备

FD-1C-50型真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；5804R冷冻离心机：德国艾本德有限公司；全波长酶标仪Multiskan GO：美国Thermo公司；RV10自动控制型旋转蒸发仪：德国IKA公司；二氧化碳培养箱：日本三洋电器公司；SHP-150生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；XSP-2C显微镜：上海精密仪器仪表有限公司。

1.2　方法

1.2.1　乳酸菌培养

L.plantarum-12以2%接种于MRS培养基中，37℃下培养24 h，传代2次。活化两次后紧接着进行扩大培养，调节培养基初始pH值至6.2。

1.2.2　L.plantarum-12发酵产胞外多糖条件的优化

1.2.2.1　碳源的优化

利用MRS培养基进行菌株L.plantarum-12产胞外多糖条件的优化，MRS培养基配方为：蛋白胨10.0 g、牛肉10.0 g、酵母膏5.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、蒸馏水1 000 mL；在此培养基中将碳源分别更换为蔗糖（10.0、20.0、40.0 g）、乳糖（10.0、20.0、40.0 g）、葡萄糖（10.0、20.0、40.0 g），121 ℃灭菌 15 min。

依照上述MRS培养基配方，设定不同的碳源及其浓度，调节培养基初始pH值至6.2。将在普通MRS液体培养基中活化第2代L.plantarum-12菌株以2%的接种量接于含有10 mL改变碳源浓度的3种MRS液体培养基的具塞试管中，置于37℃培养箱中，培养24h，不同的碳源浓度做3组平行试验。

1.2.2.2　发酵温度的优化

按照上述碳源的优化结果，改良MRS培养基，调节培养基初始pH值至6.2，将经活化的第2代L.plantarum-12菌株以2%的接种量接于含有10 mL改良过的的MRS液体培养基的具塞试管中，分别置于30、37、43℃的培养箱中，培养24 h，每个培养温度做3组平行试验。

1.2.2.3　培养时间的优化测定

按照上述试验的优化结果，改良MRS培养基，调节培养基初始pH值至6.2，将经活化的第2代L.plantarum-12菌株以2%的接种量接于含有10 mL改良过的MRS液体培养基的具塞试管中，以优化的温度，分别培养24 h和48 h，每个培养时间做3组平行试验。

1.2.3　L.plantarum-12胞外多糖的提取

将各优化条件下获得的L.plantarum-12菌株培养液，利用冷冻离心机在4℃、12 677 r/min条件下离心5 min以除去菌体得到上清液。再将上清液用旋蒸仪蒸发浓缩至原体积的1/5，加三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）至终浓度为4%后在室温条件下磁力搅拌30 min。搅拌结束后，在4℃、13 363 r/min条件下离心15 min，除去蛋白得上清液，然后加3倍体积冷无水乙醇（4℃），在冰箱中4℃静置24 h以使多糖完全沉淀。在4℃、13 363 r/min条件下离心20 min收集多糖，然后在得到的沉淀中加入适量的超纯水使其溶解，之后分装到透析袋中[16]，4℃超纯水透析3 d且每8小时换一次水以便去除小分子，然后冷冻干燥得到粗多糖样品，并用保鲜膜封口保存在干燥器中。

1.2.4　胞外多糖浓度的测定

参照魏绍云[17-18]所描述的试验方法，采用苯酚硫酸法测定各优化条件下培养液中多糖浓度。将上述得到的10 mL多糖溶液，稀释10倍，即吸取0.1 mL于试管中用蒸馏水补至1 mL，摇匀。加入0.5 mL 6%的苯酚，摇匀后迅速沿管壁加入2.5 mL浓硫酸，摇匀。室温下静置5 min，沸水浴15 min，冷却至室温。利用酶标仪于490 nm波长处测定各溶液的吸光度。每个菌株做3个平行的浓度测定，取其平均值，做方差分析。利用SPSS软件，对数据进行分析，比较他们的差异性，优选最佳发酵条件。

1.2.5　细胞培养

参考李远翰[19]的方法，在RPM1640培养液中加入10%胎牛血清（56℃灭活30 min），加入1%青霉素和链霉素。每两天换液一次，将培养液全部吸净，再加入4 mL培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。待细胞长满培养瓶面积的80%、90%左右时，可进行细胞的消化，进行后续的试验。

1.2.6　MTS法测定细胞生长抑制率

将生长至对数生长期的细胞用胰蛋白酶进行消化，用培养液补足4 mL后，在普通光学显微镜下用台盼蓝染色的方法进行计数（细胞液体积∶台盼蓝体积=9∶1）；设置1个空白对照组、1个对照组和4个试验组，用培养液稀释细胞液，以1×104个/孔的浓度接种到96孔板中，每孔200 μL细胞液，然后放到37℃的CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，试验组加入用细胞培养液稀释到不同浓度（分别为50、100、250、500 μg/mL）的乳酸菌胞外多糖粗糖，每组做6个复孔，每孔200 μL糖液，空白对照组和对照组每孔加入200 μL培养液，然后置于37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。培养48 h后，吸弃培养液并用PBS洗2次，每孔加入100 μL细胞培养液和20 μL MTS试剂，继续培养4 h，用酶标仪在490 nm处测其吸光度[20-21]。重复3次试验。HT-29细胞生长抑制率计算公式如下：

式中：A为各组的吸光度值。

1.2.7　细胞凋亡测定

本试验选用Tunel凋亡原位检测试剂盒检测乳杆菌胞外多糖引起的HT-29细胞凋亡。首先将生长至对数生长期的细胞以105个/mL的浓度接种2 mL到6孔板中的细胞爬片上，24 h后加入乳酸菌胞外多糖（浓度分别为 50、100、250、500 μg/mL）处理 48 h。之后先将培养好的细胞爬片晾干，再于固定液中室温固定1 h，之后用PBS漂洗3次，每次5 min。再将爬片浸入封闭液中室温封闭10 min，之后用PBS漂洗3次，每次5min，然后把处理好的样本浸入通透液，冰上渗透2 min。最后进行标记和显色，先把与处理好的样本PBS漂洗2次，每次5 min，然后把周围的水用滤纸吸干。处理完成后，每个样本滴加50 μL TdT反应液并加盖玻片37℃避光湿润反应1 h，反应结束后PBS漂洗3次，每次5 min。吸干样本周围的液体，再滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30 min，然后PBS漂洗3次，之后吸干液体。接下来向处理好的样本中滴加50 μL～100 μL DAB工作液，室温孵育30 min后PBS漂洗30 min，吸干PBS残留液。之后先用4%多聚甲醛固定10 min，蒸馏水洗涤2次，每次2 min，然后甲基绿染色10 min，染色完成后用蒸馏水洗涤2次，再用95%乙醇脱水5 s。最后光学显微镜下分别观察5个视野，每个视野计数100个细胞，进行数据分析。

1.2.8　乳酸菌胞外多糖抗氧化活性的测定

以DPPH自由基的清除能力为抗氧化活性指标。称取干燥的L.plantarum-12菌株粗多糖，配置浓度分别为0.10、0.30、0.50mg/mL的多糖溶液。向1 mL配置好的DPPH乙醇溶液中加入1 mL上述多糖溶液。1 mL PBS溶液中1 mL样品溶液作对照组。另取1 mLDPPH乙醇溶液加入到1 mL PBS溶液中，振荡摇匀。避光反应30 min。在4 000 r/min常温条件下离心15 min，取上清液，用酶标仪测定上清液在517 nm处的吸光度[22-23]。多糖溶液对DPPH自由基的清除率计算公式：

式中：Ac为DPPH+PBS的吸光度值；Ai为DPPH和多糖溶液的吸光度值；Aj为PBS和多糖溶液的吸光度值。

1.2.9　数据分析

所有试验重复3次或以上，结果以平均值±标准偏差表示，并经SPSS 20.0软件统计分析，多重比较采用Duncan’s检验，p＜0.05表示差异显著。

2　结果与讨论

2.1　乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化

2.1.1　碳源的优化测定

碳源的种类一直是公认的影响乳杆菌产胞外多糖的重要因素的之一，培养基中碳源的不同会导致乳杆菌的胞外多糖产量[24-27]。目前的主流碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、果糖等，本次碳源优化试验，选用葡萄糖、乳糖、蔗糖作为不同的碳源来测定它们对乳杆菌胞外多糖产量的影响。

为了很好的确定其发酵条件的最优组合，本次试验选用碳源种类、碳源浓度两个因素，每个因素分为3个水平，碳源分别改用蔗糖、乳糖、葡萄糖，碳源浓度分别取1%、2%、4%，进一步确定碳源种类和碳源浓度。利用苯酚硫酸法测得发酵液中多糖溶液吸光度值，代入标准曲线回归方程计算多糖的产量，结果如图1所示。

图1　不同碳源种类、碳源浓度的EPS产量Fig.1　EPS production with different carbon source types and carbon source concentrations

当碳源为蔗糖、其浓度为40 g/L时，胞外多糖为0.05 g，显著高于其它碳源产EPS浓度。从印度发酵饮料（Kyiad pyrsi）分离得到的菌株 Leuconstoc lactis[24]，当碳源为蔗糖时，EPS产量最高；对于L.kefiranofaciens[25]，Lactobacillus strain A[26]当碳源为乳糖时，EPS产量最高；而对于菌株YM-2，其最优碳源为葡萄糖[27]。以此说明优势碳源的利用具有菌株差异性，不同的菌株的最适碳源也都不相同，并没有适合所有杆菌的最适碳源。根据本次试验结果可以确定，L.plantarum-12菌产胞外多糖的最适碳源为蔗糖。

2.1.2　培养温度的优化测定

以蔗糖为MRS培养基的碳源，从试验2.1.1可以得出蔗糖浓度为20 g/L和40 g/L时，EPS产量均较高，结合原料用量节省和试验结果两方面考虑，接下来的试验碳源浓度选用20 g/L。L.plantarum-12菌株接种在上述MRS培养基中，在不同温度条件下培养24 h，利用苯酚硫酸法测多糖溶液吸光度值，代入标准曲线回归方程计算多糖的产量，结果如图2所示。

培养温度为43℃时，L.plantarum-12菌株EPS的产量的最低，为0.034 03mg/mL；30℃时多糖的产量最高，达到0.045 70mg/mL。在3种不同温度下，多糖的产量存在显著差异，说明发酵温度是影响多糖产量的原因。

图2　不同温度下的EPS产量Fig.2　EPS production at different temperatures

Mozzi等[28]研究发现在30℃时德式乳杆菌保加利亚嗜酸乳杆菌和嗜热乳杆菌产EPS的量达到最大。Gamar等[29]研究发现当温度在25℃～37℃变化时，在开始的5 h内，可提高乳杆菌鼠李糖亚种C83产EPS的量。Grobben等[30]发现德式乳杆菌保加利亚亚种NCFB2772在脱脂乳及限制培养基上产胞外多糖的最适温度（45℃～48℃）高于生长最适温度（37℃～42℃）。从这些文献可以发现，不同菌株的最适发酵温度也都不相同，而且同一菌株的最适产胞外多糖的温度和其自身生长的最适温度也不同。

2.1.3　培养时间的优化测定

以蔗糖为MRS培养基碳源，浓度为20 g/L，培养温度为30℃。L.plantarum-12菌株活化2代并扩大培养，利用苯酚硫酸法测定发酵液中多糖溶液吸光度值，代入标准曲线回归方程计算多糖的产量，结果如图3所示。

图3　不同培养时间下的EPS产量Fig.3　EPS production at different culture times

乳杆菌胞外多糖的生物合成还受到培养时间的影响。本研究在单因素试验中将时间条件确定为24 h和48 h。其他条件设置为蔗糖20g/L，培养温度为30℃。由图3可知，培养时间对植物乳杆菌EPS的生物合成具有重要影响。当培养时间在24 h时，乳杆菌EPS生物合成量较低；随着时间的延长，当培养时间达到48 h后，EPS的生物合成显著增加。这说明不同的培养时间对L.plantarum-12的胞外多糖的生物合成影响不同，本次试验得到的最优培养时间为48 h。

郝鲁江等[31]将发酵条件修改为培养时间33.8 h，得到EPS-PⅡ产量平均值为2.62 g/L。吴锦羽等[32]发现嗜热链球菌ST-L134-7-P的EPS在培养时间小于48 h时，产量随着时间的延长而积累增多，而48 h之后，EPS的产量开始下降并逐渐平稳。产胞外多糖乳酸菌在食品工业中前景广阔。然而，乳酸菌胞外多糖的产量一般都比较低（50mg/L～425mg/L）[33]。乳酸菌胞外多糖的产量与菌种有密切关系，菌株不同，胞外多糖合成能力差别大。同一菌株发酵条件不同，胞外多糖的产量也有明显差异。但因为EPS的功效越来越受人们关注，其能否在工业上大量生产决定了它的实用价值，研究表明，通过优化碳源、氮源、pH值、培养温度和培养时间等都能显著提高乳酸菌胞外多糖的产量[34]。

从上述结果可知，L.plantarum-12乳杆菌EPS产量的最佳条件为：碳源种类为蔗糖，碳源浓度40 g/L，培养温度30℃、培养时间48 h。因此本试验以此条件下的最优组合进行一次粗多糖的提取，通过透析冻干，获得粗多糖，经测定计算可知粗多糖提取完毕后得到的终产品有最大的EPS产量为50mg/L。

2.2　L.plantarum-12的EPS对HT-29细胞增殖的影响

利用菌株L.plantarum-12不同浓度的EPS（50、100、250、500 μg/mL）作用于 HT-29 细胞，处理 48 h，采用MTS法测定HT-29细胞生长率，结果如图4所示。

图4　Lactobacillus plantarum 12 EPS抑制HT-29细胞增殖Fig.4　Inhibition effect of EPS from Lactobacillus plantarum 12 in HT-29 cells

EPS对HT-29细胞增殖的抑制率随着EPS浓度的增加而增大，在500 μg/mL时，抑制率可达32%，显著高于（p＜0.05）其它浓度EPS处理的抑制率。采用Tunel法[35]，继续验证菌株L.plantarum-12不同浓度的EPS是否通过引起HT-29细胞凋亡。在HT-29细胞被不同浓度的EPS处理48 h后，用Tunel凋亡检测试剂盒测定细胞的凋亡情况。不同浓度EPS诱导HT-29细胞的凋亡见图5。

图5　不同浓度EPS诱导HT-29细胞的凋亡Fig.5　Induction of apoptosis of HT-29 cells by EPS at different concentrations

如图5所示，对照组每100个细胞中凋亡数为2.7个。相比之下，随着EPS作用浓度的增大，细胞凋亡数显著增多，分别为每100个细胞中有13.2、16.3、32.7和50.3个凋亡细胞。在500 μg/mL时，细胞凋亡数量在每100个细胞中可达50.3个，显著高于其它3个浓度（p＜0.05）。由此可知，L.plantarum-12的EPS诱导HT-29细胞凋亡与EPS浓度大小有关，而且，浓度越大凋亡效果越明显。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用[36]。E－waschuk 等报道了 VSL3、L.acidophilus、L.bulgaricus、L.casei、L.plantarum、B.breve、B.infantis、B.longum 和Streptococcus thermophil可降低癌细胞HT-29和Caco-2细胞的存活率并诱导其凋亡[37]。Liu Chuting等的研究结果表明L.casei胞外多糖能抑制结肠癌细胞HT-29的增殖，还可以降低4-NQO对正常肠细胞的细胞毒性作用[4]。本试验也证实了乳酸菌EPS可以诱导HT-29细胞凋亡。

2.3　乳酸菌胞外多糖的抗氧化测定

DPPH·是一种稳定合成的有机自由基。它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，而使夹在其中氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。当有自由基清除剂存在时，其孤对电子在517 nm附近有强吸收和乙醇容易呈紫色[38]。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收消失或减弱，其褪色程度与其接受的电子数呈定量关系，因而测定吸收减弱的程度可以评价自由基清除剂的活性[39]。蔡秋杏[40]研究发现分离自腌干鱼的乳酸菌所产生的胞外多糖具有较强的抗氧化能力。熊强等[41]研究发现植物乳杆菌Z22胞外多糖分离纯化后的酸性多糖EPS-S对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除率可达27.75%。本试验采用DPPH清除试验对L.plantarum-12的EPS进行抗氧化测定，结果见图6。

图6　Lactobacillus plantarum-12胞外多糖的抗氧化性Fig.6　Antioxidant activity of the EPS of Lactobacillus plantarum-12

由图6可知，随着EPS浓度升高，DPPH自由基清除率增加，在浓度为0.5mg/mL时可达51.54%。3结论

本研究通过单因素试验分析了Lactobacillus plantarum-12乳杆菌胞外多糖生物合成的最佳培养条件，得到的优化条件为：碳源种类为蔗糖，碳源浓度40 g/L，培养温度30℃、培养时间48 h，此条件下乳杆菌的EPS产量为50mg/L。

本研究中菌株L.plantarum-12的EPS对HT-29细胞增殖具有显著的抑制作用，且与EPS浓度大小有关，随着EPS浓度的增大，对HT-29细胞增殖的抑制率增加，细胞凋亡量也显著增加。L.plantarum-12胞外多糖的抗氧化性也随EPS浓度升高而显著增加。

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