HPLC法测定铁皮石斛中酚酸类物质组成及含量

（广东岭南职业技术学院，广东广州510663）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属附生多年生草本植物，是传统中草药植物，具有生津养胃、滋阴清热、降血糖、增强机体免疫力等功效，富含石斛多糖、生物碱、氨基酸、类黄酮、酚酸等对人体有益的天然药物活性物质[1-2]。其中酚酸（Phenolic acids）是指结构中含有活泼氢供体的酚羟基有机酸[3-5]，主要为苯甲酸和肉桂酸的羟化衍生物，比如香草酸、丁香酸、没食子酸、香豆酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸等。研究表明酚酸具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、抗紫外线辐射等功效[6-8]。因此进一步探明铁皮石斛中对健康起促进功效的酚酸类物质组成及其含量具有重要意义。

目前酚酸的测定方法有毛细管电泳法[9]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、液相色谱-质谱联用法（liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）[14-17]，研究对象主要为蔬菜[1]、水果[8]、水稻[10]等，但关于铁皮石斛中酚酸类物质组成及其含量的报道较少。本研究针对10份不同产地的铁皮石斛，采用甲醇超声萃取，Oasis HLB固相萃取柱净化，Hypersil BDS C18色谱柱分离，二极管列阵检测器测定，建立了高效液相色谱法同时测定13种酚酸类物质的检测方法，该法简便、高效、灵敏、准确，可为铁皮石斛酚酸组成鉴定及质量研究提供技术支持。

1　材料与方法

1.1　仪器、试剂、材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Rotavapor R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；MM400型研磨仪：德国RETSCH公司；Milli-Q Integral型超纯水机：美国Mill-pore公司；BRC-100A 30L型超声波清洗器：郑州渤锐超声波设备有限公司；BS224S型电子天平：德国Sartorius公司。

13种酚酸标准物质：没食子酸、原儿茶酸、N-p-香豆酰酪胺、松柏醇、二氢阿魏酰酪胺、丁香酸、丁香醛、香草酸、对羟基苯丙酸、对羟基桂皮酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、3-羟基肉桂酸（纯度均大于98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，具体信息见表1。乙腈、甲醇（色谱纯）：美国Fisher公司；甲酸、乙酸铵（色谱纯）：美国Sigma公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：上海安谱科学仪器有限公司；其余试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。酚酸标准储备溶液：分别准确称取适量的酚酸标准物质，用80%甲醇溶液配制成浓度为1 000 μg/mL标准储备溶液，4℃保存。

表1　13种酚酸标准物质信息表Table 1　Information table of 13 kinds of phenolic acids

10份不同产地的铁皮石斛，产地分别为安徽（大别山）、浙江（鄞县、天台、仙居）、福建（宁化）、广西（天峨）、四川（合江）、云南（石屏、文山、麻栗坡），样品经粉碎后，过200目筛，备用。

1.2　液相色谱条件

色谱柱：HypersilBDSC18（3.0μm，4.6mm×150mm）；流动相：10 mmol/L醋酸铵溶液（A）和甲醇溶液（B）；检测波长：260、280、320 nm；柱温：40℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；梯度洗脱条件见表2。

表2　洗脱梯度程序Table 2　The mobile phase gradient program of HPLC

1.3　样品前处理

准确称取2 g样品（精度至0.1mg）于100 mL离心管中，加入20 mL 80%甲醇溶液（含有1%抗坏血酸），振荡混匀后，室温下超声（300 W，40 KHz）提取30 min；加入10 mL 4mol/L NaOH溶液，充入N2后密封，37℃恒温振荡水解2 h（200 r/min）后，加入10 mol/L HCl调节pH至2。加入20 mL乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，35℃旋转蒸发近干，用6 mL 80%甲醇溶液溶解后，Oasis HLB固相萃取柱净化，净化后经0.22 μm有机过滤头过滤，滤液供液相色谱分析。

1.4　标准曲线绘制

分别移取1 000 μg/mL酚酸标准储备溶液适量置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容，配制浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的酚酸混合标准工作溶液，自动进样器进样，测定峰面积，以酚酸标准溶液质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，建立线性回归方程。

2　结果与讨论

2.1　检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对13种酚酸类物质进行紫外线扫描（190 nm～700 nm），得到13种酚酸类物质的最大紫外吸收光波长。为了获得较大的紫外吸收峰，并减少干扰，GA、PD、VA、HCA、HA 选择 260 nm 作为检测波长，紫外吸收较大，且干扰较小；TFT和HAD选择280 nm作为检测波长，紫外吸收较大，无杂峰干扰；PA、CA、SA、DH、HP、FA 选择 320 nm 作为检测波长。在260、280、320 nm 3种检测波长下，13种酚酸类物质可获得较好的色谱分离效果，紫外吸收较大、干扰小，且基线分离（图1）。

2.2　色谱柱的选择

考察了 poroshell 120 EC-C18、BEH C18、Penomenex C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C8等不同微粒填料的色谱柱对13种酚酸的分离效果（图1）。

从图1中可知：在260、280、320 nm 3种检测波长下，13种酚酸在Hypersil BDS C18色谱柱上分离效果较好，峰形尖锐且对称，故选择Hypersil BDS C18作为分析色谱柱。

2.3　流动相的选择

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙酸铵-甲醇、磷酸二氢钾-甲醇等流动相对13种酚酸色谱分离的影响。结果表明，以甲醇-水、乙腈-水和磷酸二氢钾-甲醇作为流动相时，部分色谱峰拖尾，13种酚酸化合物的色谱峰不能实现有效分离，单个化合物出现双峰；以乙酸铵-甲醇为流动相时，表现出较好的分离和洗脱能力，当乙酸铵浓度为10 mmol/L时，13种酚酸的色谱峰可得到较好的分离，基线平稳且色谱峰峰形尖锐对称（图1）。因此选择乙酸铵-甲醇作为流动相。

图1　13种酚酸标准液相色谱图Fig.1　Chromatograms of 13 standard phenolic acid

2.4　萃取溶剂的选择

考察了甲醇、乙腈、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂对13种酚酸的萃取效果（图2）。

从图2可以看出：按13种酚酸平均萃取率高低顺序排列为：乙酸乙酯（96.4%）＞甲醇（86.7%）＞二氯甲烷（79.3%）＞正己烷（71.5%）＞乙腈（68.1%）＞乙醇（63.4%），其中乙酸乙酯对13种酚酸的萃取率在88.4%～99.2%之间，平均值为96.4%。故选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

图2　萃取溶剂对酚酸萃取效果的影响Fig.2　Effect of extraction solvent on the effect of phenolic acid extraction

2.5　净化柱的选择

考察了阴离子柱Oasis MAX、弱阴离子柱Oasis WAX、阳离子柱Oasis MCX、弱阳离子柱Oasis WCX、亲水-亲酯柱Oasis HLB等不同极性固相萃取柱对13种酚酸的净化效果（图3）。

图3　固相萃取柱对酚酸净化回收率的影响Fig.3　Effect of solid phase extraction column on the recovery rate of phenolic acid extraction

从图3中可知，亲水-亲酯柱Oasis HLB净化回收效果较好，平均净化回收率为94.6%，这可能是由于Oasis HLB属于亲水-亲酯固相萃取柱，对各种极性、非极性物质都有均衡吸附作用。故选择Oasis HLB作为固相萃取净化柱。

2.6　基质效应

以铁皮石斛空白提取液作为13种酚酸标准溶液的稀释液，按照“1.4标准曲线绘制”配制一系列酚酸混合标准工作溶液，以酚酸标准溶液质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制铁皮石斛基质标准曲线，将其斜率与空白基质的标准曲线斜率相比，斜率比值在84.7%～93.6%之间。这表明铁皮石斛基质中部分酚酸存在略微的基质抑制效应。

2.7　线性范围、相关系数、检出限

在样品中添加不同浓度的酚酸标准溶液，按“1.2液相色谱条件”进行测定，以酚酸标准溶液质量浓度为横坐标（X，μg/mL），信号响度峰面积为纵坐标（A，mAu），建立标准曲线和线性回归方程；以信噪比（S/N=3）计算方法检出限（LOD），以信噪比（S/N=10）计算方法定量限（LOQ）（表3）。

表3　线性范围、回归方程、相关系数和检出限（n=6）Table 3　Linear range，regression equations，correlation coefficients and limits of detection（n=6）

从表3中可知：在 0.5 μg/mL～50.0 μg/mL 范围内，具有良好的线性关系（R2≥0.999 6）；LOD 在 0.07mg/kg～0.3mg/kg之间；LOQ在0.2mg/kg～1.0mg/kg之间。

2.8　回收率与精密度

分别在铁皮石斛样品中添加0.5、25.0、50.0 μg/mL 3种水平的酚酸混合标准溶液进行加标回收试验，每个水平重复6次，加标回收率和相对标准偏差（RSD）结果见表4。

表4　加标回收率与精密度（n=6）Table 4　Recovery and precision（n=6）

续表4　加标回收率与精密度（n=6）Continue table 4　Recovery and precision（n=6）

由表4可知，13种酚酸的加标回收率在86.7%～102.3%之间，RSD在1.1%～3.5%之间，由此可见，该方法的准确度、精密度均能满足方法学的要求。

2.9　实际样品的检测

将10份来自不同产地的铁皮石斛样品，按本文所建立的高效液相色谱法测定铁皮石斛中13种酚酸类物质组成及其含量（表5）。

结果显示：1）铁皮石斛中共检出12种酚酸，松柏醇未检出，这也许说明铁皮石斛中不含有松柏醇；所检出的12种酚酸中，阿魏酸含量最高（含量在187.3mg/kg～423.7mg/kg 之间，平均值 293.9mg/kg），其次是丁香酸、二氢阿魏酰酪胺、对羟基苯甲酸，这些酚酸类物质可能与铁皮石斛的抗氧化作用、增强免疫力、降血糖等功效有关，这为研究与开发铁皮石斛活性物质提供参考。2）来源不同的10份铁皮石斛样品中，酚酸类成分和含量均存在差异，这种差异可能是由于品种、产地、采收季节、贮藏时间等差异引起的，但这种差异作为铁皮石斛品种鉴定、真伪鉴别以及药材品质综合评价和开发利用提供科学数据。

表5　实际样品中酚酸组成及其含量Table 5　Composition and content of phenolic acids in real samplesmg/kg

3　结论

针对10份不同产地的铁皮石斛，采用甲醇超声萃取，Oasis HLB固相萃取柱净化，Hypersil BDS C18色谱柱分离，二极管列阵检测器测定，建立了高效液相色谱法同时测定13种酚酸类物质的检测方法。结果表明：在 0.5 μg/mL～50.0 μg/mL 范围内，具有良好的线性关系（R2≥0.999 6）；LOD 在 0.07mg/kg～0.3mg/kg 之间；LOQ在0.2mg/kg～1.0mg/kg之间；加标回收率在86.7%～102.3%之间，RSD在1.1%～3.5%之间；铁皮石斛中共检出12种酚酸，阿魏酸含量最高，其次是丁香酸、二氢阿魏酰酪胺、对羟基苯甲酸，这些酚酸可能与铁皮石斛的抗氧化、增强免疫力、降血糖等功效有关，这将为铁皮石斛活性物质研究与开发提供参考。

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