响应面法优化杏鲍菇多糖提取工艺

揣东华，王洪杰，张胜抗，张平平，2

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

杏鲍菇（Pleurotus eryngii var.），又名刺芹侧耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鲍鱼的口感而得名[1]。杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，适合保鲜、加工，杏鲍菇营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、维生素及钙、镁、铜、锌等矿物质，深得人们的喜爱[2]。但杏鲍菇下脚料经常被丢弃，价格便宜，营养价值与杏鲍菇差别较小，还含有多糖等活性物质，具有提高人体免疫力、抗癌、降血脂、润肠胃等作用[3]。为深入开发利用这一食用菌资源，本文对杏鲍菇内多糖的提取条件进行了研究，通过酶解提高杏鲍菇水溶性多糖的提取，在单因素试验的基础上，采用响应面法对杏鲍菇水溶性多糖的提取工艺进行优化，采取杏鲍菇下脚料提取多糖，确定杏鲍菇多糖提取工艺的最佳参数，为其进一步的开发利用提供参考[4]。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

杏鲍菇下脚料：天津市物美超市；浓硫酸、苯酚、无水乙醇：天津市永大化学试剂开发中心；纤维素酶：北京索莱宝科技有限公司；酸性蛋白酶：北京奥博星生物技术有限责任公司；试剂均为分析纯。

1.2　仪器与设备

FA2004电子精密天平：上海菁华科技仪器有限公司；752N紫外可见分光光度计：上海泸西分析仪器厂有限公司；CA-1111全自动旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司。

1.3　方法

1.3.1　酶解杏鲍菇

取新鲜杏鲍菇清洗切片打浆（杏鲍菇∶水=1 g∶1 mL），分别取100 g杏鲍菇浆到锥形瓶中，沸水10 min（灭杏鲍菇内酶），冷却至室温后加入一定量的纤维素酶与中性蛋白酶，水浴酶解一定时间后，沸水灭酶10 min，终止酶解[8]。

1.3.2　杏鲍菇多糖的提取

将酶解后的杏鲍菇浆抽滤取滤液，旋转蒸发浓缩到原滤液的1/3后，以1∶3的体积比加入无水乙醇，4℃过夜，4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，所得沉淀用无水乙醇反复清洗3次，60℃烘干，得粗多糖[9]。

1.3.3　多糖得率的计算

采用苯酚-硫酸法测多糖含量[6]。

杏鲍菇多糖得率/%=多糖含量/杏鲍菇重量×100

2　结果与分析

2.1　单因素试验

2.1.1　酶解pH值的确定

pH值对多糖得率的影响见图1。

图1　pH值对多糖得率的影响Fig.1　Effect of pH on the yield of polysaccharides

由图1可知，pH5.5时纤维素酶酶解杏鲍菇的多糖得率达到最大，所以纤维素酶酶解多糖的最佳pH为5.5。pH6.5时中性蛋白酶酶解杏鲍菇达到最高点，中性蛋白酶的最佳酶解条件为pH6.5。

2.1.2　酶添加量的确定

纤维素酶加量对多糖得率的影响见图2，中性蛋白酶加量对多糖得率的影响见图3。

图2　纤维素酶加量对多糖得率的影响Fig.2　Effect of enzyme addition on yield of cellulase

图3　中性蛋白酶加量对多糖得率的影响Fig.3　Effect of enzyme addition on yield of neutral protease

由图2可知，纤维素酶的添加量在0.9%时多糖得率最大，所以选择0.9%为纤维素酶的添加量。由图3可知，中性蛋白酶的添加量在0.2%时多糖得率最大，故选择0.2%为中性蛋白酶的添加量。

2.1.3　酶解时间的确定

酶解时间对多糖得率的影响见图4。

由图4可知，多糖得率都在3 h达到最大值，所以纤维素酶与中性蛋白酶的酶解时间选择3 h为较宜酶解时间。

图4　酶解时间对多糖得率的影响Fig.4　Effect of enzymolysis time on yield of polysaccharides

2.1.4　酶解温度的确定

酶解温度对多糖得率的影响见图5。

图5　酶解温度对多糖得率的影响Fig.5　Effect of enzymolysis temperature on yield of polysaccharides

由图5可知，随着酶解温度的增加，多糖得率都在50℃达到最大，所以纤维素酶和中性蛋白酶的最佳酶解温度都为50℃。

2.1.5　复合酶添加量的确定

由单因素试验结果确定纤维素酶与蛋白酶的最佳酶解条件相似，所以选择pH5.5，酶解时间3 h，酶解温度50℃。复合酶加量按纤维素酶0.45%和中性蛋白酶0.1%、纤维素酶0.6%与中性蛋白酶0.15%、纤维素酶0.9%与中性蛋白酶0.2%，找到最佳复合酶的添加量。复合酶添加量对多糖得率的影响见图6。

图6　复合酶添加量对多糖得率的影响Fig.6　Effect of the amount of compound enzyme on the yield of polysaccharides

由图6可知，单因素2.1.2比例混合的多糖得率最大，所以选择纤维素酶0.9%与中性蛋白酶0.2%来作为复合酶的添加量。

2.2　响应面优化法分析酶解杏鲍菇提取多糖的最佳方法

2.2.1　响应面优化提取方式

根据酶加量、酶解温度、酶解时间、pH值4个单因素试验所确定的水平范围，以多糖得率为响应值，采用 Disign-Expert软件中的 Box-Behnken Design（BBD）试验设计方法设计了四因素三水平共29个试验点的响应面试验。

表1　响应面因素水平表Table 1　Level of response surface factors

2.2.2　试验表及结果

将响应面因素水平表输入Disign-Expert软件中，得出以下试验设计表（表2），根据表格设计试验并得出试验结果Y，试验模型回归系数（表3），因素交互影响三维图（图7）。

表2　响应面试验设计表及试验结果Table 2　Response surface design table and experimental results

续表2　响应面试验设计表及试验结果Continue table 2　Response surface design table and experimental results

表3　响应面优化试验回归模型系数表Table 3　Response surface optimization experimental regression model coefficient table

图7　各因素交互对多糖得率的影响Fig.7　Effect of interaction of factors on yield of Polysaccharides

由表4方差分析得知，回归模型的F-检验极显著（P≤0.01），说明所拟合的二次回归方程合适。回归方程的A（酶添加量）、B（酶解温度）、C（酶解时间）、D（pH值）、A2、C2、D2对多糖得率的影响显著（P≤0.01）。根据回归方程，作出响应面图（图7），直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。图7所拟合的响应曲面的形状，抛物面开口向下，说明所拟合的回归模型有极大值点。从上述回归模型中求得最优条件：酶添加量纤维素酶0.9%与中性蛋白酶0.2%，酶解温度48.8℃，酶解时间2.81 h，pH值为5.439。

响应面优化试验最佳工艺条件的验证见表5。

预测多糖得率最大值3.24%。由表5可见实际与预测的多糖得率较为接近。

3　结论

杏鲍菇是近年来开发的食用和药用价值都很高的食用菌，但其子实体生产周期长、价格高，如从中提取多糖物质，成本较高，从而影响杏鲍菇多糖的开发生产，而利用下角料生产多糖活性物质，具有价格便宜、易采购、产量高等优点。研究杏鲍菇多糖的提取，可为深入开发利用这一食（药）用菌资源提供参考。本文首先通过单因素试验，确定了杏鲍菇多糖提取参数的适宜水平范围，然后，采用响应面法对杏鲍菇内多糖的提取工艺进行优化。获得杏鲍菇多糖提取的最佳工艺参数为：酶添加量纤维素酶0.9%、中性蛋白酶0.2%、酶解温度50℃、酶解时间3 h、pH5.5，提取1次，在该工艺条件下杏鲍菇多糖得率达3.12%。

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