超声辅助萃取-液相色谱-串联质谱法同时检测水产品中11种有机磷酸酯类阻燃剂

索莉莉,朱群英,胡美华

(南昌市疾病预防控制中心,江苏南昌 330038)

近年来,随着卤系阻燃剂对环境危害的加剧,其应用逐渐减少,因此,危害相对较小的磷系阻燃剂得到了广泛地应用[1]。作为一类重要的磷系阻燃剂,有机磷酸酯(organophosphate esters,OPEs)广泛应用于纺织、家用产品、建材、化工以及电子等领域。OPEs 主要以添加而非化学键合方式[2]进入材料中,且大多数具有半挥发性,因此很容易通过挥发、渗漏和磨损等方式进入周围环境中[3]。由于使用量大,OPEs引起的环境问题已不容忽视,目前已经普遍存在于水体[45]、土壤[6]和生物体[78]中。而水体中的OPEs会使各种水生生物体内的OPEs含量增多,这不仅会对鱼类及其他水生生物造成危害,更会通过食物链进一步对人体造成危害[3]。有研究表明,OPEs具有致癌性、神经毒性和生殖毒性[9]。当前,OPEs的分析检测主要集中在玩具、纺织品、木制品、土壤、水等基质较简单的样品,而鱼类等复杂水产品中OPEs的检测报道却非常少。因此,建立一种简单、快速的检测方法,并将其应用于鱼类及水产品等复杂基质中OPEs的分析检测显得尤为重要。

近年来,对于固体样品中 OPEs 的提取,主要方法有超声辅助萃取(ultrasoundassisted extraction,USAE)[1011]、微波辅助提取(microwaveassisted extraction,MAE)[7,1213]、加速溶剂萃取(ASE)[8,14]、索氏提取(Soxlet extraction,SE)[15]等。USAE方法简单、省时、有机溶剂消耗量较少。MAE具有时间短、溶剂用量少等优点,但是MAE的提取效率受溶剂的选择影响很大[16],限制了其应用及发展。ASE 自动化程度高、萃取效率高,与USAE相比,需要购买较昂贵的仪器设备。SE方法成熟、稳定,但有机溶剂消耗量大、时间长。

OPEs的检测方法主要有气相色谱法(GC)[1719]、气相色谱质谱法(GCMS)[47,11,14]、液相色谱质谱法(LCMS)[2022]等。GC和GCMS对 OPEs 具有很好的灵敏度和选择性,但是由于其普遍存在色谱峰拖尾的现象[23],制约了GC和GCMS的应用。与 GCMS 相比,LCMS 更适用于极性较强的以及分子量较大、不易挥发的 OPEs(例如 TEHP)的分析检测。

本文建立了超声辅助萃取液相色谱串联质谱法同时检测水产品中11种OPEs,本方法前处理简单、快速、基质干扰较少,萃取效率高,完全能满足对水产品中OPEs分析检测的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淡水鱼、带鱼、虾、青蛙、泥鳅和黄鳝 随机购于南昌各超市和农贸市场,去皮取肌肉部分,剁碎,在18 ℃下避光保存;磷酸三(2氯异丙酯)(Tris(2chloroisopropyl)phosphate,TCPP,纯度为99.0%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司,批号31118;磷酸三丙酯(Trisnpropylphosphate,TnPP,纯度为99.6%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司,批号105408;磷酸三(2乙基己基)酯(Tris(2ethylhexyl)phosphate,TEHP,纯度为98.0%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司,批号21120;磷酸三间甲苯酯(Trimcresyl Phosphate,TMCP,纯度为97.5%) 美国 Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批号AP16070510;三苯基氧膦(Triphenlphosphine oxide,TPPO,纯度为98.97%) 美国Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批号AL15051804;磷酸三邻甲苯酯(Triotolyl phosphate,TOTP,纯度为98.2%) 美国Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批号BL16041408;磷酸三甲苯酯(Tricresyl Phosphate,TCrP,纯度为99.8%) 美国Stanford Analytical Chemicals Inc. 公司,批号AP15042406;磷酸二苯辛酯(2Ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP,纯度为98.09%) 美国Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批号MS16040319;磷酸三苯酯(Triphenyl Phosphate,TPhP,纯度为99.82%) 美国Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批号BL16052607;磷酸三丁酯内标物(Trinbutyld27 Phosphate,TnBPd27,纯度为99.4%) 美国Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批号BC232;磷酸三异丁酯(Phosphoric Acid Tris(2methylpropyl)Ester,TiBP,纯度为98.0%) 上海ANPEL公司,批号61690004;磷酸三丁酯(Tributyl Phosphate,TnBP,纯度为99.57%) 加拿大CDN ISPTOPES公司,批号AL15120416;甲醇 LCMS级,美国Honeywell公司;二氯甲烷、正己烷、乙腈 均为色谱纯,美国Honeywell公司;四氢呋喃、丙酮 均为色谱纯,美国天地有限公司;甲酸 LCMS级,美国ANAQUA公司;超纯水 实验室自制。

LC30A型高效液相色谱仪(包括:高压泵、柱温箱、脱气机、自动进样器) 日本岛津公司;QTRAP®4500型串联质谱仪 美国AB SCIEX公司;氮吹仪 美国Organomation公司;216HL型低温离心机 SIGMA公司;KQ500DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;MilliQ超纯水仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的前处理 准确称取“1.1”所述方法处理后的样品0.5 g,加入50 μL内标物TnBPd27(1.0 μg·mL-1),混合均匀后,加入一定量的萃取溶剂,超声萃取一定时间后,12000 r·min-1离心10 min,将上清液氮吹至近干,加入甲醇溶解、定容至1 mL,12000 r·min-1离心10 min,0.22 μm有机相滤膜过滤,待测。

1.2.2 液相色谱条件 柱温:40 ℃;进样体积:10 μL;色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)不锈钢柱;流动相A为0.1%甲酸甲醇,流动相B为0.1%甲酸水,梯度洗脱程序:0.01 min,60% B;2.5 min,60% B;3 min,35% B;4.5 min,35% B;5 min,15% B;7 min,9% B;8 min,5% B;11 min,5% B;11.5 min,60% B;15 min,60% B;流速:0.4 mL·min-1。

1.2.3 质谱条件 电喷雾离子源ESI;正离子MRM扫描;离子源温度:500 ℃;离子源电压:5500 V;气帘气:35 psi;碰撞气:中等;雾化气(GS1):50 psi;辅助气(GS2):50 psi;质谱分析参数见表1。

表1 有机磷酸酯类阻燃剂的质谱分析参数Table 1 MS parameters for organophosphate esters

1.2.4 标准溶液的配制 标准储备溶液:准确称取标准品0.0100 g,用甲醇溶解并定容到10 mL棕色容量瓶中,配制成1000 μg·mL-1的标准储备溶液,在18 ℃下避光保存。

内标储备溶液:准确称取TnBPd27标准品0.0100 g,用甲醇溶解并定容到10 mL棕色容量瓶中,配制成1000 μg·mL-1的标准储备溶液,在18 ℃下避光保存。

标准工作溶液:分别取上述标准储备液适量,用甲醇定容至10 mL,配制成已知浓度的中间标准工作溶液。用甲醇稀释成系列浓度的混合标准工作溶液,密封,4 ℃下保存,备用。

内标使用溶液:准确吸取上述内标储备溶液100.0 μL,用甲醇定容至100 mL,配制成浓度为1.0 μg·mL-1的内标使用溶液,密封,4 ℃下保存,备用。

2 结果与分析

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 萃取溶剂的选择 各有机磷酸酯类阻燃剂的结构和性质不尽相同,因而不同极性有机溶剂的萃取效率也不同。考察了甲醇、丙酮、乙腈、正己烷、四氢呋喃和二氯甲烷6种不同极性的有机溶剂对水产品中11种有机磷酸酯类阻燃剂的萃取效果。在超声时间为10 min和萃取体积为10 mL的条件下,按 “1.2.1”所述进行样品处理,结果见图1。从图1可知,二氯甲烷对这11种有机磷酸酯类阻燃剂的萃取效率优于甲醇等其他5种萃取溶剂。二氯甲烷对11种有机磷酸酯类阻燃剂的萃取效率均能达到90% 以上。因此,本实验选择二氯甲烷作为最佳萃取溶剂。

图1 萃取溶剂种类对有机磷酸酯类阻燃剂萃取效率的影响Fig.1 Extraction efficiencies of OPEs by different extraction solvents

2.1.2 萃取体积的优化 萃取体积的量影响着萃取效率的好坏。在超声时间为10 min的条件下,本文考察了二氯甲烷体积(5～20 mL)对萃取效率的影响。随着萃取体积由5 mL增大到10 mL时,各有机磷酸酯类阻燃剂的萃取效率逐步提高,达到95%以上,当萃取体积增大到20 mL时,各目标物的萃取效率基本保持不变,见图2。因此,选择10 mL为最佳的萃取体积。

图2 萃取溶剂体积对有机磷酸酯类阻燃剂萃取效率的影响Fig.2 Extraction efficiencies of OPEs by different solvent volumes

2.1.3 萃取时间的优化 超声时间的长短也影响目标物萃取效率的高低。为此,本研究考察了不同超声萃取时间(2～20 min)对萃取效率的影响,见图3。由图3可见,随着超声萃取时间由2 min增加到10 min时,11种目标分析物的萃取效率逐步提高。当超声时间高于10 min,各目标物萃取效率基本趋于稳定。因此,选择10 min作为最佳的超声萃取时间。

图3 萃取时间对有机磷酸酯类阻燃剂萃取效率的影响Fig.3 Extraction efficiencies of OPEs by different extraction times

2.2 流动相的选择

本实验考察了两种有机溶剂(甲醇和乙腈)水作为流动相对11种有机磷酸酯类阻燃剂分离度和响应的影响。实验结果表明,两种有机溶剂均能达到良好的分离效果,而甲醇作为有机相时,各分析物的响应较乙腈高,因此,选用甲醇水作为本实验的流动相。同时,还考察了甲醇水、甲醇(0.1%甲酸)水(0.1%甲酸)和甲醇(0.2%甲酸)水(0.2%甲酸)为流动相对响应和峰形的影响。结果发现,随着流动相中甲酸含量的增加,TnPP、TPPO、TCPP和TEHP的响应无明显变化,其他分析物的响应则有所降低。另外,实验结果还发现,随着流动相中甲酸含量增加为0.1%,各分析物的色谱峰变得更尖锐,而当流动相中甲酸的含量增加至0.2% 时,各分析物的色谱峰形有所展宽。综合考虑以上因素,选择甲醇(0.1%甲酸)水(0.1%甲酸)作为本实验的流动相。

表 2 有机磷酸酯类阻燃剂的线性方程、相关系数、检出限、定量限及日内和日间精密度Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r),limits of detection(LOD),limits of quantitation(LOQ),intraday and interday precision of OPEs

2.3 方法验证

按照“1.2.4”所述方法配制一系列不同浓度的混合标准溶液,在“1.2.2”所述的色谱条件和“1.2.3”所述的质谱条件下对各混合标准溶液进行测定,其标准图谱见图4,结果见表2。由表2可知,11种有机磷酸酯类阻燃剂在一定浓度范围内与其对应的峰面积比(标准与内标物的峰面积比值)呈良好的线性关系(r=0.9986～0.9997),11种组分的方法定量限(LOQ,S/N=10)为 0.020～5.71 μg·kg-1,检出限(LOD,S/N=3)为 0.0060～1.71 μg·kg-1。在同一日内,对低、中、高三种浓度水平的混合标准溶液连续检测五次,得到日内精密度。并连续五日对低、中、高三种浓度水平的混合标准溶液进行检测,得到日间精密度,如表2所示。结果表明,各分析物的日内精密度为0.30%～3.0%,日间精密度为0.44%～3.7%,说明该方法的重现性良好。

图4 OPEs液相色谱串联质谱图Fig.4 LCESI+MS/MS chromatogram of the OPEs standards

同时,为验证该方法的可行性,研究了淡水鱼、带鱼、河虾、青蛙、泥鳅和黄鳝等不同种类样品低、中、高3个水平加标回收率实验,每个水平测定3个平行样。表3为各目标物的回收率及相对标准偏差。由表3可见,各样品的平均加标回收率在91.2%～110.5%之间,相对标准偏差均在 0.14%～6.6%之间,说明该方法适用于淡水鱼等6类水产品的检测。

表3 水产品中各分析物的加标回收率(%)Table 3 Recoveries of OPEs in aquatic products(%)

2.4 实际样品的测定

将随机购于南昌各超市和农贸市场的水产品样品,取肌肉部分,采用本方法对6种不同类型的水产品进行测定,结果见表4。由表4可见,这6种类型的样品中均未检出TnPP、TEHP、TOTP、TCrP、TMCP、EHDPP、TPhP和TPPO,而TiBP、TnBP和TCPP均有检出,其中TiBP的含量为1.04～1.81 μg·kg-1,TnBP的含量为0.92～1.93 μg·kg-1,TCPP的含量为23.7～30.9 μg·kg-1。图5为实际样品加标后的色谱图,由图5可见,目标化合物周围干扰较少。

图5 鱼肉样品加标后的液相色谱串联质谱图Fig.5 LCESI+MS/MS chromatogram of real fish sample spiked with OPEs

表4 水产品中各分析物的含量Table 4 Contents of OPEs in aquatic products(μg·kg-1)

这6种类型的样品中均检出了TiBP、TnBP和TCPP,经查阅了国内外文献,发现这3种分析物中,TCPP的研究最多,检出率也最高,其次是TnBP,检出率相当高,而TiBP的研究相对较少,但仍有阳性样品检出。望秀丽等[14]采用加速溶剂萃取气相色谱质谱法,检测出塑料中TCPP的含量为11.2 mg/kg;董丽君等[20]采用液相色谱串联质谱法测出木制品中TCPP的含量为0.47～6.35 mg/kg;鹿建霞等[11]采用气相色谱/质谱法检测出土壤中TCPP的含量为15.5～16.7 ng/g;秦宏兵等[5]采用固相色谱气相色谱/质谱法测得不同国家的水体中TCPP的含量为22.6～663 ng/L。鹿建霞等[11]采用气相色谱/质谱法检测出土壤中TnBP的含量为0.6～0.8 ng/g;秦宏兵等[5]采用固相色谱气相色谱/质谱法测得不同国家的水体中TnBP的含量为15～1510 ng/L;Kim[24]采用超高效液相色谱串联质谱法检测出不同种类的鱼中TnBP的含量为2.9～420 ng/g。梁钪等[22]采用超高效液相色谱串联质谱法测出污水中TiBP的含量为35.2 ng/L。另外,从这3种化合物的检出值可以看出,其含量比较接近,这是由于本课题所使用的水产品均采购于南昌市的商场和农贸市场,它们极有可能来源于同一水体也就是同一污染源中[11]。

3 结论

目前,对OPEs的分析检测主要集中在玩具、纺织品、木制品、土壤、水等基体较简单的样品,而对于复杂的生物样品如鱼肉等水产品样品中OPEs的检测报道较少。本文采用超声辅助萃取技术,以二氯甲烷为萃取溶剂提取水产品中的有机磷酸酯类阻燃剂,并应用高效液相色谱串联质谱法对水产品中的11种有机磷酸酯类阻燃剂进行测定。该方法前处理简单快速、基质干扰少、萃取效率高。应用此方法能够实现水产品中多种OPEs的同时测定。

[1]隋强男,翟玮,耿存珍. 有机磷酸酯类阻燃剂在环境中的最新残留现状研究[J]. 环境科学与管理,2015,40(10):3134.

[2]王晓伟,刘景富,阴永光. 有机磷酸酯阻燃剂污染现状与研究进展[J]. 化学进展,2010,22(10):19831992.

[3]王艺璇,段玉双,耿存珍. 有机磷酸酯在水环境中的残留及生态风险评价[J]. 环境与健康杂志,2015,32(10):935939.

[4]Yan X J,He H,Peng Y,et al. Determination of organophosphorus flame retardants in surface water by solid phase extraction coupled with gas ChromatographyMass spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2012,40(11):16931696.

[5]秦宏兵,范苓,顾海东. 固相萃取气相色谱/质谱法测定水中6种有机磷酸酯类阻燃剂和增塑剂[J]. 分析科学学报,2014,30(2):259262.

[6]郑春莉,冯珊珊,杜苗苗,等. 固相微萃取/气相色谱质谱联用技术在有机磷酸三酯阻燃剂土壤吸附分析中的应用[J].西安交通大学学报,2015,49(11):128134.

[7]Ma Y Q,Cui K Y,Zeng F,et al.Microwaveassisted extraction combined with gel permeation chromatography and silica gel cleanup followed by gas chromatographymass spectrometry for the determination of organophosphorus flame retardants and plasticizers in biological samples[J].Analytica Chimica Acta,2013,786(13):4753.

[8]Sundkvist A M,Olofsson U,Haglund P.Organophosphorus flame retardants and plasticizers in marine and fresh water biota and in human milk[J].Journal of Environmental Monitoring,2010,12(4):943951.

[9]Meeker J D,Stapleton H M.Urinary phthalate metabolites in relation to preterm birth in Mexico city[J].Environmental Health Perspectives,2009,117(10):15871592.

[10]Cristale J,Lacorte S.Development and validation of a multiresidue method for the analysis of polybrominated diphenyl ethers,new brominated and organophosphorus flame retardants in sediment,sludge and dust[J].Journal of Chromatography A,2013,1305(1):267275.

[11]鹿建霞,季雯,马盛韬,等. 气相色谱/质谱法检测灰尘、土壤和沉积物中有机磷酸酯[J]. 分析化学,2014,42(6):859865.

[12]GarciaLópez M,Rodriguez I,Cela R,et al.Determination of organophosphate flame retardants and plasticizers in sediment samples using microwaveassisted extraction and gas chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Talanta,2009,79(3):824829.

[13]董丽君,许美玲,张丽,等. GCMS和LCMS/MS检测木制品中三种有机磷酸酯阻燃剂[J]. 湖北林业科技,2016,45(5):4952,54.

[14]望秀丽,于文佳,卫碧文,等. 加速溶剂萃取气相色谱质谱法测定塑料中7种有机磷酸酯阻燃剂和增塑剂[J]. 分析实验室,2017,36(1):109113.

[15]温家欣.有机磷酸酯阻燃剂的分离分析技术及其应用研究[D].广州:中山大学硕士学位论文,2010:19,37,51.

[16]刘艺凯,唐建辉,潘晓辉,等. 环境中多溴联苯醚分析方法的研究进展[J].环境化学,2012,31(12):19081915.

[17]范华锋,刘萍,李登昆. 固相萃取气相色谱法测定饮用水中11种有机磷阻燃剂[J]. 江苏预防医学,2015,26(6):3234.

[18]潘萌,宋淑玲,王媛,等. 气相色谱火焰光度法测定水体中9种有机磷酸酯阻燃剂[J]. 分析测试学报,2015,34(12):13771381.

[19]曾铭,喻零春,蒋小良,等. 气相色谱法测定玩具中的3种有机磷阻燃剂[J]. 化学试剂,2014,36(7):643645.

[20]董丽君,张丽,许美玲,等. 液相色谱串级质谱同时测定木制品中3种有机磷酸酯阻燃剂[J]. 南方林业科学,2016,44(6):6569.

[21]张楠,张斌,禹伟腾,等. 超高效液相色谱质谱法测定纺织品中禁用的9种有机磷阻燃剂[J]. 分析实验室,2015,34(12):14111414.

[22]梁钪,牛宇敏,刘景富. 超高效液相色谱串联质谱法测定污水中14种有机磷酸酯阻燃剂[J]. 环境化学,2014,33(10):16811685.

[23]高立红,厉文辉,史亚利,等. 有机磷酸酯阻燃剂分析方法及其污染现状研究进展[J]. 环境化学,2014,33(10):17501761.

[24]Kim J W,Isobe T,Chang K H,et al.Levels and distribution of organophosphorus flame retardants and plasticizers in fishes from Manila Bay,the Philippines[J].Environmental Pollution,2011,159(12):36533659.