香橼多酚提取工艺优化

张 然,徐 敏,何婷婷,蔡 畅

(常熟理工学院生物与食品工程学院,江苏常熟 215500)

香橼(CitrusmedicaL.)为芸香科柑橘属植物,又名枸橼子,《本草图经》记载香橼具有止咳化痰、理气和中的作用[12]。现代医学研究也发现香橼在抑制动脉扩张和治疗肝炎方面有显著疗效,香橼名列2016年国家卫生计生委发布的《既是药品又是食品的名单》中,是一种药食两用原材料。在我国大部分香橼生长在云南、福建、浙江、江苏、广西、湖北等地[3],因其具有较强的观赏价值,目前已发展成为江苏和浙江两省及上海市重要的庭院、道路绿化树种,香橼果实产量逐渐丰富,香橼的食品产业开发有广阔前景。香橼中含有丰富的营养素和生物活性物质,目前国内对香橼功效成分提取的研究主要在果胶、柚皮苷和挥发油组分方面[3],关于香橼多酚提取的报道很少,植物多酚是植物中具有多元酚结构的物质,主要存在于植物的根、皮和果实中,是植物体内复杂酚类的次生代谢产物[46],现代研究认为植物多酚具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂及抗癌等生物学作用[7]。

本文以香橼为主要原料,以乙醇为溶剂提取香橼中多酚,并且对相应提取工艺进行优化,从而为香橼食品深加工产业提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香橼(干品) 江苏龍升药业有限公司;没食子酸标准品 上海如吉生物对照品专用;福林酚试剂 苏州晶茂生物科技有限公司;碳酸钠 天津市永大化学试剂有限公司,乙醇 天津永大化学试剂有限公司;蒸馏水 实验室自制。

紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;EL204型电子精密天平 梅特勒托利多仪器有限公司;HMS112型电热式恒温水浴锅 江苏金坛宏凯仪器厂;1011AB型电热鼓风干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司;HK20B型摇摆式高速中药粉碎机 广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 香橼55 ℃烘干4 h至恒重、中药粉碎机打碎,过60目筛→精确称量→加入一定浓度乙醇溶液→选择一定温度置于恒温水浴锅→浸提一定时间→过滤→水浴→收集香橼多酚醇提液。

1.2.2 标准曲线的绘制 精确吸取0、1、2、3、4、5、6 mL 0.1 mg/mL没食子酸溶液于10 mL容量瓶中,定容。再各取1 mL稀释液于试管中,分别加入0.5 mL福林酚试剂与2 mL 10%的碳酸钠,定容到10 mL,45 ℃水浴30 min,冷却后用蒸馏水作为空白,可见分光光度计在765 nm下测得吸光度值,每个样品平行测定三次。以没食子酸标准溶液的浓度(mg/mL)为横坐标,以吸光度值作为纵坐标,绘制相应的标准曲线,所得标准曲线的方程为:Y=10.604X+0.0117,R2=0.9998。

1.2.3 香橼多酚得率计算 取1 mL提取后的溶液,分别滴加0.5 mL福林酚试剂与2 mL 10%的碳酸钠溶液,用蒸馏水精确定容到10 mL,放置于45 ℃的水浴锅中水浴30 min,于765 nm处测其吸光度,按照标准曲线测定香橼中多酚浓度。多酚得率公式如下:

式中,C为提取液中多酚的浓度(mg/mL);V为提取液体积(mL);n为稀释倍数,m为香橼粉的质量(g)。

1.2.4 香橼多酚提取的单因素实验

1.2.4.1 乙醇体积分数对香橼多酚得率的影响 按照料液比1∶20 g/mL,提取温度70 ℃,提取时间60 min;以不同乙醇体积分数(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液为提取液,考察乙醇体积分数对香橼多酚得率的影响。

1.2.4.2 料液比对香橼多酚得率的影响 在乙醇体积为40%,提取温度70 ℃,提取时间60 min条件下,分别选择料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL以研究不同料液比对香橼多酚得率的影响。

1.2.4.3 提取温度对香橼多酚得率的影响 在乙醇体积为40%,料液比为1∶15 g/mL,提取时间60 min条件下,分别选择提取温度40、50、60、70、80、90 ℃以研究不同提取温度对香橼多酚得率的影响。

1.2.4.4 提取时间对香橼多酚得率的影响 在乙醇体积为40%,料液比为1∶15 g/mL,提取温度为60 ℃条件下,测定提取时间 40、60、80、100、120 min时香橼多酚得率,研究不同提取时间对香橼中多酚得率的影响。

1.2.5 香橼多酚提取的正交实验设计 以香橼多酚得率为评价指标进行单因素实验,在单因素实验基础上,设计四因素三水平正交实验,确定提取香橼多酚的最佳工艺,因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3 数据处理

实验结果以均值±标准差(mean±SD)表示,每个处理重复3次,采用SPSS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数对香橼多酚得率的影响 由图1可知,乙醇体积分数在30%到40%之间,香橼多酚得率上升速度最快,乙醇体积分数40%时香橼多酚得率达到最高,这可能是由于乙醇体积分数过低不利于有效成分的溶解和吸收。乙醇体积分数上升到40%以后,随乙醇体积分数升高香橼多酚得率反而下降。这可能是因为乙醇体积分数较大时,容易导致多酚类物发生醇解,而且叶绿素等物质溶出也增多,干扰因素的影响也增强,导致香橼多酚得率反而下降[8]。因此乙醇的适宜浓度为40%。

图1 乙醇体积分数对香橼多酚得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentvation on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.注:不同小写字母代表组间差异显著(p<0.05),图1～图4同。

2.1.2 料液比对香橼多酚得率的影响 由图2可知,在料液比由1∶10 g/mL到1∶15 g/mL时,香橼多酚得率迅速上升,料液比在1∶15 g/mL达到最高值为23.53 mg/g,当料液由1∶15 g/mL到1∶30 g/m时,香橼多酚得率缓慢下降。料液比为1∶15 g/mL时,多酚得率最高,与其他料液比相比多酚得率差异显著(p<0.05)。因此,1∶15 g/mL为适宜料液比。

图2 料液比对香橼多酚得率的影响Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.

2.1.3 不同提取温度对香橼多酚得率的影响 由图3可知,随着提取温度的升高,香橼多酚的得率先上升后下降,60 ℃时达到最高。这是由于提取温度上升引起分子加速运动,导致多酚加速渗出,因此表现为香橼多酚得率上升[9];当温度升高到60 ℃时,香橼多酚得率开始下降,这可能是由于多酚的热稳定性较差,长时间受热发生氧化水解。因此60 ℃为适宜提取温度。

图3 提取温度对香橼多酚得率的影响 Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.

2.1.4 不同提取时间对香橼多酚得率的影响 由图4可知,提取时间在40 min至100 min时,随提取时间延长,香橼多酚得率逐渐升高,在100 min时香橼多酚得率到达最大值24.59 mg/g,与其它提取时间存在显著差异(p<0.05),提取时间大于100 min后随提取时间的延长香橼多酚得率反而逐渐减少,这可能是因为随时间延长香橼多酚氧化受损引起的[1011]。因此,100 min为适宜提取时间。

图4 提取时间对香橼多酚得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield of polyphenols from Citurs medica L.

2.2 正交实验

根据极差R的大小,判断香橼多酚提取的各因素影响作用由强至弱为:B>C>A>D(即料液比>提取温度>乙醇体积分数>提取时间)。表2可以看出提取香橼多酚的最佳工艺为A1B3C3D2,即乙醇体积分数30%,料液比1∶20 g/mL,提取温度70 ℃,提取时间100 min。

表2 正交实验结果Table 2 Experimental design and result of orthogonal experiments

2.3 验证实验

在最佳工艺条件下:1 g香橼,20 mL体积分数为30%的乙醇溶液于70 ℃水浴锅中提取100 min,重复三次,计算平均值,见表3,该条件下香橼多酚得率为40.13 mg/g。

表3 验证实验结果Table 3 Experimental resuts of verify tests

3 结论

通过单因素实验和正交实验,确定了从香橼中提取多酚的最佳工艺参数为:乙醇体积分数30%,料液比1∶20 g/mL,提取温度70 ℃,提取时间100 min,在此最优条件下,多酚得率为 40.13 mg/g。本实验为香橼的进一步纯化和活性研究奠定了基础,也为香橼的综合利用提供技术参考依据。

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