羊布鲁氏菌病实验室常用检测方法对比试验

阿力米古丽·乌米尔哈孜

（新疆塔城地区动物疾病控制与诊断中心，塔城 834700）

0 引言

布鲁氏杆菌病是由布鲁氏杆菌感染引起的一种急慢性人畜共患病。除感染羊和人类外，还可危害牛、猪等动物。该种致病菌对妊娠动物造成的危害严重，其他动物感染该种致病菌后不会表现出明显的临床症状，很难在较短时间内作出诊断，很难及时对病情做出诊断，当出现典型临床症状后，表示病情已经严重传播流行。由于布鲁氏杆菌病属于国家二类动物传染性疫病，同时也是一种人畜共患病，确诊后，在做好患病羊扑杀处理同时，还应做好羊群净化处理。而在对患病羊进行诊断和羊群净化处理过程中，通常选择使用虎红平板凝集试验和试管凝集试验进行针对性诊断，逐步净化羊群，培育无病羊群。为进一步探讨上述2种实验室检测方法的准确性，研究主要在3个规模化羊养殖场分3个批次采集了3 000份新鲜血液，进行血清学检查，对比2种检测方法的准确率和灵敏度。

1 试验材料与方法

1.1 材料选取

羊血清主要采自于新疆塔城地区3个规模化养殖场，共分3个批次进行集中采集，共采集3 000份，将采集到的新鲜血液带回实验室，常规方法分离得到血清，-20 ℃低温保存。研究选择的虎红平板凝集试验抗原和阳性血清、试管凝集试验抗原和阳性血清，均来自于青岛易邦生物工程有限公司，生产批号分别为兽药字（2011）150138017和（2011）150138011。

1.2 方法

首先，血液采集和血清制备。分3个批次在新疆塔城地区3个规模化养殖场采集羊的新鲜血液。采集时，先将羊保定，将静脉表皮的羊毛消毒剔除后，采集静脉新鲜血液。血液采样后，用标记笔在采血器上注明对应的羊耳标号，除去针头后放置在保温箱内保存，及时送回实验室进行离心处理，得到上层血清，血清制备完成后，放置于-20 ℃的冰箱内保存[1]；其次，虎红平板凝集试验。虎红平板凝集试验操作应严格按照中华人民共和国相关标准进行，使用标记笔，在灭菌干净的玻璃板上编号，用移液器吸取30 μL虎红平板凝集抗原，然后分别吸取采集到的血清30 μL，与虎红平板凝集抗原混合均匀，同时设置阳性对照组，如果待检血清出现颗粒或絮状物凝集判定为阳性，完全不凝集判定为阴性[2]；再次，试管凝集试验。试管凝集试验操作也需要严格按照国家相关标准进行，对试管标记，向第1个标记好的试管内添加1.15 mL的稀释液，剩余的试管中可添加0.5 mL的稀释液，使用移液器，在第1个试管中加入待检血清0.1 mL，用移液器连续吹打5～6次，混合均匀后，吸取0.25 mL混合液舍去，再吸取0.5 mL混合液，加入到第2个试管，按照上述方法混合均匀，再吸入第3个试管，混合液0.5 mL，依次稀释到第4个试管。确保试管稀释度分别为1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100，然后再向试管中添加20倍稀释的抗原稀释液，每个试管中添加0.5 mL，充分震荡混合均匀，确保血清稀释度控制在1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。同时设置阴性对照组、阳性对照组、抗原对照组，并配制比浊管振摇均匀。将全部的试管放置在37 ℃保温箱内，持续培养24 h，取出试管后记录检查结果，以比浊管为标准进行判定，对比上层液体的清亮程度。“4+”表示完全凝集，全部下沉，上层液体100%清澈；“3+”表示几乎凝集，上层液体100%清澈；“2+”表示显著凝集，上层液体50%清澈；“+”表示有沉淀，上层液体25%清澈；“-”表示无沉淀，液体均匀阴性[3]；最后，灵敏度对比试验。为有效检测上述2种方法的灵敏度，将虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测为阳性的血清分别进行虎红平板凝集和试管凝集交叉试验，验证第1次检测出阳性血清的2种方法的准确度。

2 结果

2.1 虎红平板凝集与试管凝集试验检测对比

通过使用虎红平板凝集试验和试管凝集试验，对3 000份血清分别进行检测，其中第1个批次的513份羊血清中虎红平板凝集试验检测出13份，试管凝集试验共检出阳性血清12份，检出率分别为2.53%、2.34%。第2批1 269份羊血清中虎红平板凝集试验检测出16份，试管凝集试验共检出阳性血清17份，检出率分别为1.26%、1.34%。第3批1 218份羊血清中虎红平板凝集试验检测出14份，试管凝集试验共检出阳性血清16份，检出率分别为1.15%、1.31%，见表1。

表1 虎红平板凝集试验与虎红平板凝集试验检测对比

2.2 虎红平板凝集与试管凝集试验灵敏度对比

将第1次检测为阳性的血清分别进行其他2种检测方法再次检测，检测结果显示，第1次虎红平板凝集试验检测出来的50份阳性血清，试管凝集试验检测45份全部为阳性，有5份为阴性。试管凝集试验检测出来的45份阳性血清中经虎红平板凝集试验检测，45份全部呈阳性。由此可知2种检测方法以试管凝集试验检测灵敏度和准确度更高，虎红平板凝集试验检测过程中可能存在假阳性。

3 结束语

羊布鲁氏杆菌病检测过中应用较为常见的检测方法主要为虎红平板凝集试验和试管凝集试验2种。通过本次检测结果可知，虎红平板凝集试验的检出率高于试管凝集试验，总体检出率分别为1.67%和1.50%。为进一步验证2种检测方法的灵敏度，将上述2种方法第1次检测出来的阳性血清分别再进行交叉检测。检测结果显示，虎红平板凝集试验检测出来的50份阳性血清中，有45份阳性，5份阴性。试管凝集试验检测出来的45份血清中应用虎红平板凝集试验再次检测，全部为阳性，由此可知虎红平板凝集试验检测存在假阳性，其灵敏度相对于试管凝集试验较低。但由于该种检测方法具有较强的特异性，因此可以将其作为初步羊布鲁氏杆菌阳性血清筛选检测和流行病学调查，然后将筛选出来的阳性血清进行试管凝集排除假阳血清，将2种方法有效结合，实现优势互补。

在今后羊布鲁氏杆菌检测时应结合实际情况，选择合适的检测手段，将虎红平板凝集试验和试管凝集试验有效结合，极大提高防控质量，提高检测准确率，减少疾病传播蔓延。