伊犁马LTF基因多态性与产奶量相关性分析

杨　坤，高　源，邬明丽，蓝贤勇，雷初朝，陈　宏，刘武军，党瑞华*

(1. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 新疆农业大学 动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

马奶的营养价值高且易消化吸收，各种成分与人乳相近，是一种比较理想的饮用食品[1]。自古以来在新疆地区的少数民族就有饮用酸马奶的习惯，且酸马奶可做药用。随着人民生活水平的不断提高，马奶产品以其独特的营养特性和保健特性正被越来越多的人们所接受。随着马奶的需求日益增多，发展马乳产业存在很大潜力[2]。

乳铁转运蛋白(lactotransferrin，LTF)也称为乳铁蛋白(lactoferrin，LF)，是一类具有抗菌和免疫调节特性的糖原，属于转铁蛋白家族，在各种分泌物和组织中均有表达[3]。乳铁转运蛋白以其广谱抑菌作用著称，常被添加在食品及饲料中抗贫血、治疗乳腺疾病和增强免疫力。婴儿奶粉中添加乳铁蛋白，能改善肠道微生物菌群、促进铁吸收、降低脂质氧化[4]，因其不易失活、功能稳定的特性，也被作为动物饲料的绿色添加剂[5]。此外，也有学者报道中国荷斯坦牛LTF基因上的SNPs与日均产奶量、乳脂率等产奶性状显著相关[6]。Pawlik等[7]发现LTF基因c.33G>A、c.-926G>A、g.109741625A>G 3个SNPs可作为波兰荷斯坦牛泌乳性状优良标记位点，证明其可能是家畜泌乳性能相关候选基因。目前，家马上关于LTF的研究多集中于其免疫作用，未见泌乳性状相关分析[8]。

伊犁马是我国培育的以速度快、挽力好、适应性强而著称的乘挽兼用型优良马种[9]。中国没有专门化乳用马品种，目前，关于中国家马品种泌乳性能相关基因的研究甚少，尚未见到对伊犁马产奶性能育种值估计和评价的相关报道[10]。本试验初步研究了伊犁马LTF基因CDS区SNP多态，并将发现的SNP位点与其日均产奶量进行关联分析，筛查了与泌乳性能相关的多态位点，为中国乳用马的高效选育、种质资源保存与利用提供一定的依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1试验用马试验所用的马匹全部来自新疆伊犁昭苏马场，放牧、饲养和管理条件相同，年龄(约为5～6岁)、胎次(3～4胎)及产驹时间相近的伊犁马成年母马共224匹，其中有产奶记录的73匹。

1.1.2主要试剂琼脂糖、丙烯酰胺、血液基因组DNA提取试剂盒、核酸染料、DL50 Marker、DL2000 Marker、Mixture、双蒸水、TBE缓冲液等。

1.1.3引物设计合成根据NCBI上家马LTF基因序列(NC_009159)设计引物，扩增马LTF基因CDS区及启动子区域(表1)。引物使用NCBI在线引物设计工具设计，送上海生工生物工程有限公司合成。

表1　引物序列、扩增区域、片段长度及退火温度Table 1　The primer sequence, amplified region, fragment size and annealing temperature

1.2　试验方法

1.2.1血样采集及指标测定对73匹伊犁马分别进行颈静脉采血，5～8 mL/只，加入枸缘酸钠抗凝，-80 ℃保存备用，并记录统计其120 d产奶量。

1.2.2基因组DNA的提取采用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用核酸蛋白测定仪测定浓度，-20 ℃保存备用。从所采集样品中选取个体差异较大的个体构建DNA池[11]。

1.2.3DNA池PCR扩增利用构建的DNA池进行PCR反应。PCR反应体系为为25 μL：DNA模板4 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，双蒸水6.5 μL。

PCR反应条件： 95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存备用。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4直接测序及BLAST检测选取特异性好、产量高的PCR产物送西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。利用DNASTAR 7.1软件中的SeqMan程序对测序结果进行校正和BLAST分析确定SNPs。

1.2.5PCR-RFLP分析根据发现的LTF基因SNP位点，使用WatCut限制性内切酶在线工具网站(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)分析并选择合适的限制性内切酶，使用NCBI在线引物设计网站设计酶切引物，扩增伊犁马LTF相关基因SNP位点。

PCR反应体系为12.5 μL，包括：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 6.25 μL，双蒸水4.75 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s：60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存.

获得的PCR产物与相应的限制性内切酶进行酶切，酶切体系为5 μL PCR产物、9 μL ddH2O、2 μL buffer缓冲液、3 μL限制性内切酶，混匀后37 ℃消化过夜，1%琼脂糖凝胶或10%聚丙烯酰胺胶电泳检测酶切片段，凝胶成像系统观察并用Excel记录分型结果。

1.3　数据处理分析

1.3.1伊犁马产奶数据采集根据伊犁马生理特点，分别在一天的12、14、16、18时挤奶，称量并记录120 d内每匹伊犁马的产奶量。用萨伊金公式计算母马日均产奶量，方法如下：

W=G×24/h(W：一昼夜产奶量；G：12 h挤出的全部奶量；h：挤奶时间总和)

泌乳期短于120 d的校正到120 d，超过120 d的截止至120 d的产奶量，校正公式如下：

120 d校正产奶量=实际产奶量×实际产奶天数对应的校正系数

使用Excel对产奶量数据进行整理。

1.3.2伊犁马LTF基因多态与日均产奶量关联分析使用SPSS 19.0软件对伊犁马日均产奶量与SNP多态性进行单因素方差分析(ANOVA)，分析LTF基因多态性与伊犁马日均产奶量的相关性。

2　结果与分析

2.1　PCR产物检测结果

部分1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果见图1。从图1以看出，特征性扩增良好，片段整齐、单一无拖尾，目的片段长度与预期结果相符，可直接用于后续分析。

2.2　PCR产物序列分析

选取扩增较好的DNA池PCR产物送西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序，对测序结果应用DNA Star软件中的Meg Align和Seq Man程序进行组装、拼接。比较发现，在伊犁马LTF基因第二外显子中检测到一个SNP位点：c.173 G>A。DNA池测序结果见图2。

图1　部分LTF基因引物PCR扩增结果M. Marker DL2000;1-4. PCR产物；a. Exon 2;b. Exon 3Fig.1　The partial electrophoretogram for PCR of LTF geneM. Marker DL2000;1-4. PCR product;a. Exon 2;b. Exon 3

2.3　伊犁马LTF的PCR-RFLP分析结果及群体遗传结构分析

根据测序结果，使用PCR-RFLP法对224匹伊犁马样品的SNP位点进行分型，选用XmnⅠ内切酶进行酶切，分型结果如图3所示。根据酶切结果统计样本基因型，对LTF基因多态位点的杂合度

图2　DNA池测序结果Fig.2　The results of DNA pool sequencing

(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)进行分析，进行哈代-温伯格平衡检测，结果如表2所示。根据Botstein多态信息含量分类标准，PIC>0.5为高度多态性位点，0.5>PIC>0.25为中度多态性位点，PIC<0.25为低度多态性位点。由表可见，所检测的位点属于中度多态，且不满足哈代-温伯格平衡。LTF基因的优势等位基因型为GA，优势等位基因为G，多态信息含量为0.37。

2.4　伊犁马泌乳相关基因多态性与日均产奶量关联分析

选择胎次和年龄相近的73匹伊犁马母马，记录统计其日均产奶量及该SNP位点基因型数据。使用IBM SPSS Statistics 19将其泌乳数据与该位点的基因型进行单因素方差分析，分析结果见表3。从表3中可见，该位点与伊犁马日均产奶量之间不存在显著相关。

图3　伊犁马LTF基因PCR-RFLP分型电泳图Fig.3　 The electrophoretogram for PCR of Yili equine LTF geneM. Marker DL2000

注：df=2，χ20.05(2)=5.99，χ20.01(2)=9.21，PIC>0.5为高度多态，0.25

Note：df=2，χ20.05(2)=5.99，χ20.01(2)=9.21，PIC>0.5 for highly polymorphic，0.25

3　讨　论

本研究分析了伊犁马品种LTF基因的外显子及启动子序列，并将发现的多态与伊犁马日均产奶量进行了关联分析。在伊犁马LTF基因中检测到1个SNPs : c.173 G>A，该位点可致LTF蛋白第58位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸。使用PCR-RFLP方法对该位点进行分型并进行群体遗传结构分析，结果显示，该位点在伊犁马群体中为中度多态且不处于哈代-温伯格平衡。与其日均产奶量进行关联分析后发现，该位点不同基因型的日均产奶量差异不显著，但各基因型的产奶量GG>GA>AA。

表3　伊犁马LTF基因不同基因型与日均产奶量的关联分析Table 3　Correlation analysis of different genotype and daily milk yield of LTF gene in Yili equine

注：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

Note：P<0.05 is significant difference，P<0.01 is extremely significant difference.

LTF具有广谱抑菌作用，与动物的免疫功能息息相关，也有学者报道LTF基因可能是家畜泌乳性能相关候选基因，但对该基因的报道仍然较少，因此该基因在群体中可能尚处于选育状态，受到选育的力度较大而处于不平衡状态。

通过对试验过程及结果分析判断，c.173 G>A位点位于LTF基因CDs区上，是错义突变，但表型差异仍然不显著，可能因为发生突变的氨基酸并不在蛋白质的活性区域上。此外，由于满足年龄、胎次相近的马匹样本数量较少，泌乳性能数据仅有日均产奶量一项，关联分析的结果与实际可能存在差异。如果能得到更多性状的生产数据，进一步进行关联分析，可使结果更加可靠。

泌乳性状作为一个数量性状，它的表现不仅受基因的影响，还有环境的作用。产奶量是一个遗传力极低的性状，常规选育并不能使其大幅度提高，分子遗传学的发展使标记辅助选择(MAS)更加便捷，而科研人员需要做的就是找到影响产奶量性状的候选基因。目前，国内外研究发现了大量存在于外显子和内含子中的变异，而这些突变也为MAS提供了参考，但关于马泌乳性能的有效标记还没有发现。因此我们下一步的工作便是寻找影响马产奶量的有效候选基因，为中国乳用马的高效选育、种质资源保存与利用提供了一定的依据。

参考文献：

[1]叶再华.伊犁马种质特性研究[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学,2008.

[2]姚新奎，韩国才.马生产管理学[M]. 北京：中国农业大学出版社,2008.

[3]KOLM G，KNAPP B，WAGNER R，et al. Lactoferrin，a glycoprotein with immunomodulatory and mast cell stabilising properties，in skin of horses suffering from Culicoides hypersensitivity[J].Research in Veterinary Science，2007，38(2):165-170.

[4]罗芳. 牛初乳中乳铁蛋白分离纯化工艺及生物活性研究[D].湖南长沙：湖南农业大学，2010.

[5]郝丽媛，孙鹏，卜登攀，等. 乳铁蛋白检测及应用研究进展[J].中国畜牧杂志，2016,52(1):82-86.

[6]李强子，马生虎，徐军，等. 中国荷斯坦牛LF基因多态性与泌乳性状及乳腺炎的关联分析[J]. 浙江农业学报，2016，28(7)：1 142-1 147.

[7]PAWLIKA A，SENDRG G，SOBCZYNSKAM M，et al. Association between lactoferrin single nucleotide polymorphisms and milk production traits in Polish Holstein cattle[J]．Archi Fur Tierzucht，2014,57:1-12.

[8]PEARL C A，ROSER J F. Lactoferrin expression and secretion in the stallion epididymis[J]. Reproductive Biology，2014，14(2):148-154.

[9]裴红罗.个体年度性能指数和体尺细分法在竞赛用伊犁马选择上的应用研究[D].新疆乌鲁木齐：新疆农业大学，2003．

[10]王军，何美升，刘玲玲，等. 伊犁马泌乳性能遗传参数及育种值估计的研究[J].新疆农业科学，2015,52(9):1 757-1 763.

[11]刘彬,宋桃伟,罗卫星,等.GHSR基因多态性与黔北麻羊生长性状关联性分析[J].广东农业科学，2013,40(22):161-165.