犬诱导发情与超数排卵试验

赵兴旺

（新疆石河子总场兽医站，新疆 石河子 832000）

0 前言

同情发情、超数排卵、体外受精、胚胎移植、克隆和转基因等技术，在国内外重多科技人员的不懈努力之下取得了突飞猛进的发展和广泛的应用，尤其在牛羊等动物的繁殖和育种方面已经获得明显的经济效益。但有关犬的同情发情、超数排卵、胚胎移植、克隆和转基因技术等方面的研究资料还是比较局限和少见的。

犬属于非季节发情动物，在一年中有2个区分不太明显的发情繁殖季节，即春季（3～5月）和秋季（9～11月），部分犬在冬、夏季也可发情。一般每6～7个月发情1 次，也就是说在一年中可发情2 次，并可配种，产2 窝仔。獒犬只在秋冬季发情1 次。犬的发情周期分为发情前期（流血期） 、发情期（配种期）、妊娠期/发情后期（黄体作用期）和休情期（静止期、非繁殖期）。发情前期，生殖器官开始为卵巢排出卵子做准备，新生的卵泡开始发育和迅速增长，卵泡中充满了卵泡液。生殖道上皮开始增生，腺体活动开始加强，分泌物增多，外阴充血，阴户肿胀，黏膜潮红湿润，流出混有血液的粘液，持续时间5～20 d，平均9 d。发情期犬发情征兆明显，并接受公犬交配，此期的母犬外阴肿胀变软并出现皱褶，阴道流出的粘液颜色变淡，出血减少或停止，接近和接受交配，持续时间7～12 d，平均为9 d。妊娠期从卵子受精（最后一次配种）开始计算，为58～63 d，平均为60 d。发情后期若没有配种或者配种没有怀孕，子宫粘膜都要在黄体的作用下发生增生，子宫壁增厚，为胚胎的发育做准备，可持续30～90 d，平均60 d ，所以犬很容易出现假孕。

本试验是对非发情非繁殖季节的母犬从同期发情（人工诱导发情）和超数排卵两方面进行探索性研究，其目的是为了对非繁殖季节的优良犬种（如獒犬）的同期发情、克隆和胚胎移植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

小型杂种母犬4 只，年龄6月龄左右，体重4～5 kg，购进后分笼饲养观察15 d，无发情和生殖道疾病，分为2 组，每组2 只进行试验。

1.1.2 试验器械和药品

黄体酮注射液（宁波市三生药业有限公司）、氯前列醇注射液（上海市计划生育科学研究所）、笨甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂）、注射用孕马血清（宁波第二激素厂）、注射用促黄体素释放激素A3（LHRH-A3：上海市计划生育科学研究所）、促卵泡激素释放激素（FSH：加拿大）、阴道海绵孕酮栓、注射器、生理盐水、甲醇液、姬姆萨染液、载玻片、手术刀、手术剪、止血钳、肠钳、持针钳、缝线、创巾、止血纱布、采胚管、显微镜等。

1.2 试验方法与程序

A 组（阴道孕酮海绵栓+笨甲酸雌二醇+促卵泡激素释放激素（FSH）+氯前列醇+促黄体素释放激素A3 组）：在第0 天埋置阴道孕酮海绵栓，第13 天撤除阴道海绵栓，第13 天至第16 天每天肌肉注射1 次雌二醇500 μ/kg 和促卵泡素5 mg/kg，第17 天肌肉注射1 次氯前列醇0.1 mg/kg、促卵泡素20 mg/kg 和促黄体释放激素0.2 μg/kg，第18 天（阴道流血）上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素20 mg/kg 和促黄体释放激素0.2 μg/kg； 第19 天上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素20 mg/kg 和促黄体释放激素0.4 μg/kg，第20 天上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素10mg/kg 和促黄体释放激素0.6 μg/kg，第21 天上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素5 mg/kg 和促黄体释放激素0.8 μg/kg。第22 天用手术摘除犬的子宫和卵巢，在体视显微镜下收集卵母细胞。

B 组（黄体酮+ 笨甲酸雌二醇+ 氯前列醇+ 孕马血清+ 促卵泡激素释放激素（FSH）组）：在第0～7 天，肌肉注射黄体酮1 mg/kg，第8 天至第13 天肌肉注射黄体酮0.5 mg/kg，第14 天和第16 天肌肉注射1 次雌二醇500 μg/kg 和马血清25 iu/kg，第17 天肌肉注射1 次氯前列醇、孕马血清25 iu/kg 和促卵泡素20 mg/kg，第18 天（阴道流血）上午和下午各肌肉注射1 次马血清25 iu/kg 和促卵泡素20 mg/kg，第19 天上午和下午各肌肉注射1 次孕马血清30 iu/kg 和卵泡素10 mg/kg。第20 天和第21 天上午和下午各肌肉注射1 次孕马血清50 iu/kg 和促卵泡素5 mg/kg。第22 天用手术摘除犬的子宫和卵巢，在体视显微镜下收集卵母细胞。

1.3 阴道分泌物——角化磷状上皮细胞的检查与发情观察

试验开始后的第7 天对所有试验母犬每天用生理盐水浸湿的棉签，从阴道中旋转粘取阴道分泌物，均匀涂抹在载玻片上，甲醇固定，干燥后姬姆萨染色10～20 min，置显微镜下观察角化磷状上皮细胞的数量。同时观察临床发情情况。

1.4 试验母犬卵的收集

同情发情的第22 天用无菌手术方法取完整的子宫和卵巢，在试验室观测子宫和卵巢的形态变化，然后用灭菌的生理盐水冲洗子宫，并收集冲洗液，在显微镜下观察和寻找卵细胞或者将整个卵巢用手术刀切碎（越碎越好，充分释放卵细胞），并收集卵细胞。

2 结果与分析

2.1 同情发情情况

A 组试验犬在试验的第13 天表现为阴唇肿胀，阴门下角悬垂有浑浊的带有褐色液体小滴，撤除阴道海绵栓并冲洗阴道3 h 后，从阴道中流出大量血样黏性分泌物，阴道黏膜水肿呈玫瑰红色，阴道黏膜形成纵向皱褶，触诊整个阴唇发硬，母犬之间有的相互爬跨，在试情中不愿意接受公犬爬跨，到第16 天阴门肿胀开张，阴道黏膜变为淡红色，在试情公犬的试情过程中，母犬很愿意接近公犬，表现为后躯高抬，尾巴歪向一侧，露出会阴区。

B 组试验犬在试验的第13 天表现为阴唇肿胀，并从阴道流出大量血样黏性分泌物，阴道黏膜水肿呈玫瑰红色，阴唇肿胀发硬，阴道黏膜形成纵向皱褶，触诊整个阴唇发硬，母犬之间有的相互爬跨，在试情中不愿意接受公犬爬跨，此阶段可认为是发情前期。到第17 天，试验犬阴门肿胀开张，阴道黏膜变为淡红色，在试情公犬的试情过程中，母犬很愿意接近公犬，表现为后躯高抬，尾巴歪向一侧，露出会阴区，此阶段可认为是发情前期。

2.2 阴道黏液角化磷状上皮细胞的数量和形态

A 组和B 组母犬均在试验后的第14 天阴道分泌物中开始有少量的角化磷状上皮细胞出现。其中：A1 犬第14 天出现少量的角化磷状上皮细胞，维持到第15 天，第16 天所增加，第17 天出现大量的角化磷状上皮细胞，持续维持到第21 天；A2 犬第14天出现少量的角化磷状上皮细胞，第15 天有所增加，第16 天出现大量的角化磷状上皮细胞，维持到第19 天，第20 天和第21 天，有所减少；B1 犬第14天出现少量的角化磷状上皮细胞，维持到第16 天，第17 天有所增加，第18 天出现大量的角化磷状上皮细胞，维持到第21 天；B2 犬第14 天出现少量的角化磷状上皮细胞，维持到第15 天，第16 天有所增加，第18 天出现大量的角化磷状上皮细胞，维持到第21 天（见表1）。

表1 阴道涂片法的鉴定结果

显微镜镜检观察发现，第14 天阴道中脱落的角化磷状上皮细胞角化不完全，细胞开始形变，轮廓变得扁平而钝圆，染色颜色较淡，部分细胞核开始空泡化，有的已经消失，可见有数量较多的红细胞；第17天或者第18 天出现大量的角化磷状上皮细胞，细胞角化严重，绝大部分细胞的细胞核已经消失，而且细胞体积变大，形状不规则。涂片中亦可见微量的红细胞。

通过发情临床观察、阴道黏液的角化磷状上皮细胞的检查结果显示：A、B 两组犬均在同期后的第14 天进入发情前期，规律比较一致。4 只犬进入发情排卵期的时间分别为A1 犬第16 天、A2 犬第17天、B1 犬和B2 犬均为第18 天，A、B 两组犬进入发情排卵期的时间有一定的差异性，A 组提早于B 组进入发情排卵期。

2.3 犬子宫形态变化和卵母细胞回收数量

对子宫和卵巢进行大体解剖和组织形态学变化观察：A 组和B 组的4 只犬均表现为子宫明显肿胀、光亮，呈粉红色，子宫切开后子宫壁明显增后，子宫腔积有少量的稀薄分泌物，黏膜层显著肿胀，充血，呈淡红色。切开卵囊包膜，卵巢形状不规则，卵巢体积明显增大，卵巢的表面有大小不一、突出的卵泡，里面充满淡黄色透明的液体。子宫和输卵管的冲卵液以及切碎卵巢液的显微镜观察结果显示：4 只同期发情犬均观察到卵细胞，所回收的卵细胞均为卵母细胞，其中A1 犬140 枚，A2 犬145 枚，B1 犬378 枚，B2 犬480 枚，B 组犬的收集到的卵母细胞数量是A 组犬的3 倍，B 组犬超数排卵效果明显高于A 组。

3 小结与讨论

雌性动物在正常生殖生理的情况下，1个雌性哺乳动物一生中卵细胞的数量在20万～40万枚之间，而最终能形成为成熟的卵细胞并排出的极少，大部分在发育的不同阶段闭锁消失[1]，这就限制了优秀母畜后代数量的扩大。超数排卵技术的研究开始于20 世纪20年代，1927年Smith 和Engle 首先发现了超数排卵现象，他们在性成熟的小鼠身上进行了垂体前叶组织肌肉埋植试验，结果从输卵管收回了60 多个卵子，是正常数量的4～5 倍。此后不久，Cole 和Hart 发现了孕马血清可使未成熟大鼠超数排卵，从而奠定了超数排卵技术的基础。

生长期的排卵数由以下因素决定：（1）初级卵泡发育成生长卵泡的比例；（2）生长卵泡的生长率；（3）生长卵泡的闭锁率。超数排卵处理就是增加早期卵泡发育到高级阶段卵泡的数量，或者降低发育卵泡的闭锁率，是一个连续的动态过程。这一过程受中枢神经系统、垂体前叶和卵巢间激素调控[2]。超数排卵处理可改变这一生理过程。常见方法有：（1）降低或消除卵巢对促性腺激素释放的负反馈反应，主要针对促卵泡素；（2）提高血液中促性腺激素浓度。生产中广泛采用这一方法。它常与刺激内源促性腺激素释放的方法结合进行。动物对超数排卵处理的反应很不稳定：排卵数、可获得排卵数、所获得的卵子质量都很不稳定，这种不稳定性已成为目前阻碍家畜胚胎移植技术应用而亟待解决的问题。

药物A 组（阴道孕酮海绵栓+ 笨甲酸雌二醇+促卵泡激素释放激素+ 氯前列醇+ 促黄体素释放激素A3 药物组）和药物B 组（黄体酮+ 笨甲酸雌二醇+ 氯前列醇+ 孕马血清+ 促卵泡激素释放激素），组方虽然有所不同，但从作用机理方面没有根本性不同，然而试验结果有显著的差异性，尤其在提早发情排卵和超数排卵效果方面，B 组明显好于A 组，究其原因可能与阴道埋置孕酮海绵栓14 d后，会导致阴道分泌物腐败恶臭和阴道发炎，继而引起生殖系统发生炎症，减弱了激素对卵巢的作用，影响了超数排卵效果有关。

本试验结果显示，无论是孕酮阴道海绵栓+ 笨甲酸雌二醇+ 促卵泡激素释放激素（FSH）+ 氯前列醇+促黄体素释放激素A3 组（A 组），还是黄体酮+笨甲酸雌二醇+ 氯前列醇+ 孕马血清+ 促卵泡激素释放激素（FSH）组（B 组），均能诱导非发情季节的非发情母犬的同期发情和超数排卵，同期发情和超数排卵效果良好。试验方法和试验结果可为犬的同期发情、适时配种、胚胎移植、卵母细胞的体外培养成熟、克隆胚胎的制作及生产的广泛深入研究提供参考。