免疫性血小板减少患者外周血Treg及Th1，Th2细胞检测及其临床意义*

高　硕，徐学静，王　森，程　莉，陈军浩，孙　健

(南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京　210008)

原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)是临床常见的自身免疫性出血性疾病。患者血小板数量降低，以皮肤、黏膜及内脏出血为主要临床表现，发病率有不断增高趋势[1]。ITP的发病机制涉及多个方面，目前仍未被完全阐明。近年来研究发现T淋巴细胞亚群的异常在ITP免疫发病机制中发挥关键作用[2]。本研究针对临床ITP患者，采用流式细胞术检测外周血Treg细胞及Th1/Th2细胞比例，旨在探讨这几类T淋巴细胞亚群数量变化对ITP疾病发生和进展的重要作用。

1　材料和方法

1.1研究对象选取2015年9月～2016年9月在我院就诊的ITP患者27例作为研究对象。其中男性11例，女性16例，中位年龄41岁。25例健康志愿者作为对照组，其中男性9例，女性16例，中位年龄44岁。入选对照组对象均排除自身免疫性疾病。所有患者及健康志愿者于清晨空腹抽取全血。其中1 ml采于EDTA抗凝管内，用于Treg细胞检测。4 ml采于肝素锂抗凝管内，用于Th1/Th2细胞检测。

1.2试剂和仪器流式抗体CD3(PerCP)，CD8(APC)，IL- 4(PE)，IFN- γ(FITC)，IgG2a(PE)，IgG1(FITC)，FACSLysing溶血液及细胞刺激剂leukemia activation均购自Becton Dickison公司。Treg检测试剂盒购自eBioscience公司。固定破膜剂FIX&PERM Kit购自Life Technologies公司。实验所用仪器：FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickison公司)，二氧化碳培养箱(Thermo Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1Treg细胞检测：实验按照Treg检测试剂盒操作说明书进行。对照管和实验管中分别加入CD4(FITC)和CD25(APC)各5 μl，两管中均加入50 μl全血，混匀后室温避光孵育15 min。每管加入Flow Cytometry Staining Buffer各1 ml，500 g离心5 min，弃上清。加入500 μl Fixation/Permeabilization试剂，混匀后室温避光孵育30 min。再加入800 μl Permeabilization Buffer，500 g离心5 min，弃上清。对照管加入Rat IgG2a(PE)抗体5 μl，实验管加入FoxP3(PE)抗体5 μl，置室温避光孵育30 min。生理盐水洗涤一次，加入360 μl Flow Cytometry Staining Buffer混匀后上机检测。采用CD4+细胞设门方法，检测CD25+FoxP3+细胞比例。

1.3.2Th1/Th2细胞检测：对照管和实验管均加入1 μl细胞刺激剂至管底。两管中各加入50 μl全血，振荡混匀，于37℃，5 mg/dl CO2培养箱孵育4.5 h(每2 h震荡混匀一次)。孵育后两管中加入CD3(PerCP)和CD8(APC)抗体各5 μl，混匀，室温避光孵育15 min。各管中加入50 μl固定剂A，避光孵育15 min。生理盐水洗涤，尽量倒尽上清液。各管再加入50 μl破膜剂B，实验管中加IL- 4(PE)和IFN- γ(FITC)标记抗体各5 μl，对照管加入相应同型对照抗体，室温避光孵育30 min。生理盐水洗涤后制成360 μl细胞悬液，上机检测。为排除在刺激培养过程中PMA对CD4标记的影响，采用CD3+CD8-设门方法代替CD4+细胞群，检测IFN- γ(Th1)和IL- 4(Th2)阳性细胞比例。

2　结果

2.1ITP患者组与健康对照组Treg细胞检测结果流式细胞仪检测结果显示，ITP患者组Treg细胞占CD4+细胞比例的(2.20±0.93)%，健康对照组为(2.99±0.45)%，ITP患者外周血Treg细胞比例低于健康志愿者，两组间差异有统计学意义(t=3.820，P=0.000 4)。

2.2ITP患者组与健康对照组Th1/Th2细胞检测结果见表1。流式细胞术分别检测ITP患者组和健康对照组CD4+细胞中IFN- γ(Th1)与IL- 4(Th2)阳性细胞比例。与健康对照组相比，ITP患者外周血Th1和Th2细胞比例差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 ITP患者组与健康对照组Th1/Th2细胞水平比较

3　讨论

原发性免疫性血小板减少症(ITP)是临床较常见的以血小板减少和出血为特点的自身免疫性疾病。其发病机制涉及机体对血小板和巨核细胞表达的糖蛋白的免疫耐受缺失，表现在抗血小板抗体产生以及血小板破坏过多或生成减少。近年来国内外研究发现，T细胞数量和功能异常参与了ITP的发生发展[3]。作为具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群，Treg及Th1/Th2细胞在ITP中的作用越来越受到关注。

调节性T细胞是机体诱导和维持自身免疫耐受的重要细胞。其中CD4+CD25+ Foxp3+(Treg)是最经典的Treg细胞的免疫表型。Treg细胞能抑制效应细胞的增殖及免疫活性的发挥，同时在肿瘤免疫及变态反应性疾病中发挥重要作用[4]。有研究发现Treg细胞数量减少和功能异常与多种自身免疫疾病相关[5，6]。ITP作为常见的自身免疫病，其疾病进程中Treg细胞可能发挥的作用引起了许多关注。国内外多数的研究结果表明，ITP患者外周血Treg细胞数量有明显降低[7，8]。然而也有研究者提出不同意见，他们发现ITP患者Treg细胞数量与健康对照组相比并没有差异[9]。在本研究中我们检测了ITP患者外周血Treg细胞比例。结果显示，与健康对照组相比ITP患者外周血Treg细胞水平明显降低，与大多数的研究结果一致，提示Treg数量减少可能是影响ITP疾病发生发展的重要因素。

Th1/Th2细胞是CD4+T辅助细胞中重要的两个亚群。Th1细胞介导细胞免疫应答，包括迟发型超敏反应和器官特异性自身免疫性疾病等。Th2细胞介导体液免疫应答，在过敏性和感染性疾病、拮抗胞外病原体、B细胞增殖分化以及哮喘病等方面具有重要作用[10]。有研究表明ITP患者体内存在Th1/Th2失衡的现象，而对这一现象的研究结论并非十分一致。唐玉荣等[11]的研究表明在急性ITP患儿外周血中Th1细胞占主要优势，而有研究则发现IL- 4等细胞因子在ITP患者中升高，提示ITP发病可能与Th2功能亢进有关[12]。本研究在对Th1/Th2细胞水平检测中发现，ITP患者组Th1/Th2平均水平与健康对照组相比并无统计学差异，其中约1/3患者Th1细胞水平较高，而少部分患者Th1细胞少，Th2细胞比例相对增高。这一结果提示ITP患者可能存在个别Th1/Th2失衡的现象，没有证据表明哪种细胞占主要优势，可能与样本数量少及患者自身免疫状态有关。

综上所述，本研究发现ITP患者外周血Treg细胞数量减少，Th1/Th2细胞水平没有明显变化。对Treg及Th1/Th2细胞水平的检测，有助于了解ITP患者的免疫状态，为疾病进展及免疫治疗和预后提供一定的临床依据。今后的研究仍需增加样本数量，并观察患者治疗前后T淋巴细胞亚群数量和功能的变化及与临床特征的相关性，为ITP发病机制的深入研究和寻求临床新的治疗手段提供理论依据。

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