多发性骨髓瘤患者血清中lncRNA PCAT- 1的表达水平与临床预后研究*

盘国雄，谭才燕，何嘉颖，梁梓钊　

(肇庆市第二人民医院，广东肇庆　526060)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)属于浆细胞恶性肿瘤，发病率为15%，居于血液恶性肿瘤第二位，近年来调查显示其发病率呈逐年上升的趋势，治愈较难，患者预后差，因此探究其发病机制对于其治疗、预后十分有必要[1，2]。长链非编码RNA(long non- coding RNA，lncRNA)在机体的生长发育以及组织分化中发挥重要的调控功能，近年来较多研究显示lnc RNA与肿瘤的发生、发展密切相关，在正常组织以及肿瘤组织中能够特异性表达，可作为肿瘤的预测因子[3]。目前有研究显示lncRNA与MM患者病情进展以及预后有关[4]。本研究通过检测MM患者血清中lncRNA转录产物1(prostate cancer- associated transcript1，PCAT1)的表达，旨在探究其临床意义以及与患者预后的相关性。

1　材料与方法

1.1研究对象选取2013年2月～2014年6月在我院进行初步确诊的72例MM患者作为研究对象，所有患者均符合《血液病诊断及治疗标准》中MM诊断标准，男性41例，女性31例，年龄43～79岁，平均年龄59.34±7.26岁，临床分期I期33例，II期24例，III期15例；疾病分型IgG型30例，IgA型21例，IgD型9例，轻链型11例，不分泌型1例。另选取同期在本院进行体检的60例正常者作为对照组，其中男性37例，女性23例，年龄44～79岁，平均年龄58.64±8.31岁，两组在性别、年龄方面对比，差异无统计学显著性意义(P>0.05)。纳入标准：①年龄≤80岁；②符合张之南《血液病诊断及治疗标准》(2007年)中诊断与分期标准[5]；③均经临床诊断、骨髓象、骨骼X线等检测确诊；④患者知情同意。排除标准：①接受抗骨髓瘤治疗；②HIV阳性者；③存在严重感染性疾病；④痴呆、癫痫等精神障碍者。

1.2仪器和试剂ND- 2000核酸测定仪购自美国Thermo Scientific公司；96孔PCR仪购自Bio- Rad公司；5418低温离心机购自德国Eppendorf公司；RNA反转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；SYBR Mix购自日本Taraka公司。

1.3方法

1.3.1血清样本采集：清晨空腹状态下，采集受试者3 ml静脉血，置于离心机中3 000 r/min离心15 min，收集血清溶液，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.2RT- PCR法测定血清中lncRNA PCAT- 1表达：采用Trizol法提取血清中总RNA，并用核酸测定仪测定RNA含量，取2 μg用RNA反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。lncRNA PCAT- 1以及内参GAPDH引物由广州Invitrogen公司合成。lncRNA PCAT- 1上游引物为5’- AATGGCATGAACCTGGGAGGCG- 3’，下游引物为5’- GGCTTTGGGAAGTGCTTTGGAG- 3’；β- actin序列：F：5’- CCTTACGCCAACACAGTGC- 3’，R：5’- ATACTCCTGCTTGCTGATCC- 3’。反应体系为20 μl包括：10 μl 2×SYBR Mix，10×cDNA 1 μl，上下游引物各1 μl，H2O 8 μl，每个样品为3个重复。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃30 s,60℃30 s，72℃1 min，40 cycles；72℃延伸10 min。在荧光定量PCR仪上进行反应。反应结束后利用CFX manager 3.0软件对结果进行Cq值分析，以GADPH作为内参按照2- ΔΔCq算法进行基因相对表达量分析。

1.3.3治疗方法：患者采用VAD方案进行治疗，静脉推注0.5 mg长春新碱(山西振东泰盛制药有限公司；批号：C14200031673，规格：1 mg)，第1～4天；静脉滴注10 mg多柔比星(上海复旦张江生物医药股份有限公司；批号：C14207011976，规格：2 mg)，第1～4天；口服20 mg地塞米松(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：C14200004087，规格：0.75 mg)，第1～4天，9～12天，17～20天，28天为1个疗程。

1.3.4疗效评价标准：根据国际骨髓瘤规定的MM疗效国际统一标准，主要分为严格完全缓解、完全缓解、部分缓解、病情稳定、病情进展，肿瘤治疗有效率=(严格完全缓解+完全缓解+部分缓解)/治疗总例数×100%。

1.3.5随访：所有患者进行三年随访，采用电话以及复查方式进行随访。主要记录①无生存进展期(progression free survival，PFS)：患者接受治疗到发现肿瘤进展或死亡这一段时间；②总体生存时间(overall survival，OS)：患者接受治疗到末次随访或死亡这段时间。

2　结果

2.1两组血清中PCAT- 1mRNA表达量相比较MM组血清中PCAT- 1mRNA表达量(2.65±0.64)高于对照组(1.06±0.23)，差异有统计学意义(t=18.276，P=0.000)。

2.2MM患者PCAT- 1mRNA表达与临床特点的关系见表1。根据MM组血清测定平均值，将PCAT- 1mRNA>平均值的44例患者作为高表达组，≤平均值的28例患者作为低表达组，两组在性别、临床分期、病理分型在血红蛋白、浆细胞、血小板、清蛋白、β2- MG，CRP方面对比，差异无统计学意义(χ2=0.001～3.345，均P>0.05)。Ca2+≥10 mg/dl高表达组患者比例(57.14%)明显高于低表达组(27.27%)，差异有统计学意义(χ2=5.229，P=0.022)。

表1 PCAT- 1mRNA表达与MM患者临床特点的关系[n(%)]

2.3MM患者PCAT- 1mRNA表达与患者治疗效果关系PCAT- 1mRNA低表达组治疗有效39例，高表达组治疗有效21例，两组治疗有效率对比(88.64% vs 75.00%)，差异无统计学意义(χ2=2.291，P=0.130)。

2.4MM患者PCAT- 1mRNA表达与患者预后的关系PCAT- 1高表达、低表达组无生存进展(PFS)和总体生存(OS)对比，差异有统计学意义(χ2=7.269，P=0.007；χ2=9.190，P=0.002)，见图1。将单因素分析中年龄，Ca2+水平以及PCAT- 1mRNA表达纳入COX风险回归多因素分析，显示年龄、PCAT- 1mRNA表达量为影响患者预后的独立因素(OR=3.275，P=0.025，95%CI：2.691～3.761；OR=2.136，P=0.046，95%CI：2.034～2.685)。见表2。

注：A.两组PFS曲线对比；B.两组OS曲线对比

表2 MM患者COX风险回归分析

3　讨论

长链非编码RNA属于非编码蛋白质，但具有重要的调控功能。较多研究显示其在机体内生命活动中发挥着重要功能，能够通过改变染色体的结构以及稳定mRNA结构，对mRNA翻译以及蛋白的合成、加工等过程进行调控[6，7]。近年来研究显示lncRNA PCAT- 1参与基因组印记、染色体X沉默以及转录激活与干扰等多种细胞生理过程[8]。另外也有研究提示部分lncRNA在病灶组织与正常组织中表达具有明显差异性，可能参与肿瘤的发生，如前列腺癌、膀胱癌、肺癌、脑膜瘤、胰腺癌等肿瘤[9]，但在MM中研究的较少。

本研究结果显示MM患者血清中PCAT- 1mRNA表达量高于对照组，这与Shen等[10]研究结果相似，表明PCAT- 1 mRNA表达异常可能与MM的发生有关。PCAT- 1是近期在前列腺癌中发现的RNA序列，主要定位于人染色体8q24区域。临床已被证实作为前列腺癌的致癌因子，能够诱导癌细胞的增殖，并且影响化疗敏感性[11]。目前在其它肿瘤中也有相关研究，Prensner等[12]报道其在原发性肝细胞癌和结直肠癌组织中呈上调表达，此外研究还显示PCAT1能够抑制BRCA2的表达(BRCA2是抑癌基因)，使其对PARP1抑制剂极其敏感，因此在同源重组时造成功能性缺陷。Liu等[13]研究显示降低PCAT- 1表达能够诱导人膀胱癌细胞凋亡。Zhao等[14]研究显示在非小细胞肺癌组织PCAT- 1mRNA表达量明显高于癌旁组织，体外研究也显示PCAT- 1在非小细胞肺癌细胞株A549，SPC- A- 1中mRNA表达量明显高于正常人支气管上皮细胞16HBE。另外有研究显示PCAT- 1过表达可显著促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进一步说明PCAT- 1具有致癌作用[15]。以上研究均说明PCAT- 1参与肿瘤的发生以及进展，并且有可能参与MM的发生。

本研究结果MM患者PCAT- 1mRNA表达与患者年龄以及血钙含量相关，提示高龄患者以及血清中钙含量较高者易出现PCAT- 1 mRNA高表达。PCAT- 1与肿瘤患者临床病理参数关系密切，有研究显示肺癌组织中PCAT- 1表达与患者性别、年龄、是否吸烟、淋巴结转移以及肿瘤分化程度不相关，而与肿瘤大小、病理分级以及临床分期呈显著正相关，表明PCAT- 1参与肺癌的发展过程[12]。Shen等[10]研究显示MM患者血清中PCAT- 1与血清β2- MG以及LDH活性呈显著性正相关，间接说明PCAT- 1可作为MM诊断指标。而治疗效果对比方面，MM PCAT- 1不同表达患者无明显差异，说明PCAT- 1表达与患者治疗效果无相关性，后期可能需要进一步扩大样本进行验证。

在不同肿瘤中PCAT- 1mRNA的表达与患者的预后密切相关。Ge等[16]研究显示在大肠癌患者中PCAT- 1高表达与肿瘤远处转移相关，认为PCAT- 1mRNA高表达为大肠癌患者独立预后因素。Yan等[17]研究显示在肝癌患者中，PCAT- 1呈现高表达并且与临床分期以及预后相关。Shi等[18]研究认为PCAT- 1mRNA的高表达与食管鳞癌患者的临床分期与预后密切相关。本研究随访结果显示PCAT- 1高表达者PFS，OS低于低表达组，说明PCAT- 1高表达者预后较差，生存率较低。进一步进行COX风险回归分析，结果显示年龄、PCAT- 1mRNA表达量为影响患者OS的独立性预后因素，提示高龄以及PCAT- 1mRNA高表达者是影响患者生存的危险因素，应提前进行预防治疗以提高患者生存率。

综上所述，PCAT- 1mRNA在MM患者中呈高表达，并且与患者PFS，OS相关，推测PCAT- 1可作为 MM诊断和预后的标志物，可能为MM治疗的靶点，但具体分子机制还有待后续深入研究。

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