宫颈癌患者血浆miRNA- 10b的表达及其临床意义*

冯　磊，常春红，管晓卿，汪新宇，郭甜静　

(涿州市医院妇产科，河北涿州　072750)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，其发病率有逐年上升和年轻化发展的趋势，已成为严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一[1]。宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是宫颈癌的癌前病变，早期诊断和治疗CIN对于预防宫颈癌有着重要的意义。近年研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在肿瘤发生、发展及转移中起着重要的作用，其中miRNA- 10b与多种恶性肿瘤的发生有关，可能在肿瘤发生过程中发挥癌基因的作用[2，3]。本研究通过检测血浆miRNA- 10b在宫颈癌患者中的表达情况，分析其表达与宫颈癌临床病理特征间的关系，旨在为宫颈癌的早期诊断及靶向治疗提供依据。

1　材料与方法

1.1研究对象选取2014年3月～2017年3月河北省涿州市医院妇产科收治的宫颈癌患者168例，年龄29～76(47.36±10.85)岁。纳入标准：①符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准和WHO分级标准，且经病理确诊为宫颈癌者；②术前均未接受放射治疗、化疗及生物免疫治疗者；③能配合本次研究及病历资料完整者。宫颈癌临床分期：I期58例，Ⅱ期67例，Ⅲ期25例，Ⅳ期 18例；病理类型：鳞状细胞癌140例，腺癌28例；病理分级：G1 34例，G2 56例，G3 78例；有淋巴结转移45例，无淋巴结转移123例。另取同期与宫颈癌患者年龄匹配的CIN患者68例(CIN Ⅱ 21例，CIN Ⅲ 47例)作为CIN组和正常健康女性45例作为对照组。宫颈癌组、CIN组和对照组间年龄、体质指数、婚姻状况、吸烟史、饮酒史、家族史及流产史比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。所有研究对象均于清晨空腹抽静脉血5 ml，离心分离血浆后保存于-80℃冰箱待检。

1.2方法

1.2.1主要试剂和仪器：RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT- PCR)。

1.2.2miRNA的提取：取300 μl血浆样本，加入1 ml总miRNA提取液，按照血液总miRNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)说明书从血浆中提取总RNA。

1.2.3miRNA逆转录及RT- PCR检测：以U6为实验内参，miRNA逆转录反应体系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP)，1.00 μl逆转录酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反转录缓冲液，0.19 μl RNase抑制剂(20 U/μl)，4.16 μl无菌三蒸水。反应条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存，进行逆转录反应。以U6为实验内参，反应体系为20 μl：1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00 μl TaqMan⑧Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液，1.33 μl反转录产物cDNA，7．67 μl DEPC水。扩增条件为：95℃10 min 1个循环，95℃15 s，60℃60 s进行40个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定阈值的经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用2- △△Ct法计算miRNA- 10b的相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.4血浆鳞状细胞癌抗原(SCCA)和癌胚抗原(CEA)检测：分别采用贝克曼和罗氏电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒，化学发光法测定SCCA和CEA水平，操作过程严格按照说明书进行。

2　结果

2.1各组血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA表达水平比较见表1。宫颈癌组血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA表达水平均明显高于CIN组和对照组，差异有统计学意义(F=17.842，13.614，8.273，均P<0.01)；而CIN组与对照组血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA表达水平比较

2.2宫颈癌患者血浆miRNA- 10b表达与临床病理特征的关系见表2。随着宫颈癌临床分期的进展，miRNA- 10b表达水平逐渐升高，Ⅲ～Ⅳ期宫颈癌患者中miRNA- 10b表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异有统计学意义(t/F值=19.287，P<0.01)。血浆miRNA- 10b表达水平与淋巴结转移、浸润深度及SCCA水平也相关(t/F值=21.528，5.672，5.284，均P<0.05)，而与年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小、绝经状态及CEA水平差异无统计学意义(t/F值=0.462，0.714，0.487，0.828，0.318，0.663，均P>0.05)。

表2宫颈癌患者血浆miRNA- 10b表达与临床病理特征的关系

　　组　别nnmiRNA⁃10b(2⁃△△Ct)t/F值P值年龄(岁)　<45　　　　　≥45临床分期　Ⅰ～Ⅱ期　　　　　Ⅲ～Ⅳ期798912543572±193594±177341±124827±3150462　192870513　<0001病理类型　鳞癌　　　　　腺癌14028604±185568±16207140426病理分级　G1　　　　　G2　　　　　G3345678595±182573±168586±17504870509肿瘤大小　≤4cm　　　　　>4cm9771571±165603±19408280314淋巴结转移　是　　　　　　否45123338±126841±31721528<0001绝经　是　　　否56112580±176587±18203180627浸润深度　≤1/2肌层　　　　　>1/2肌层65103415±134806±32656720012SCCA(ng/ml)　<60　　　　　　　≥607890426±137793±30852840018CEA(ng/ml)　<50　　　　　　　≥5010761576±173592±18506630482

2.3血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA对宫颈癌的诊断价值见表3。血浆miRNA- 10b，SCCA，CEA及三项联合诊断宫颈癌的曲线下面积(AUC)及95%CI分别为0.836(0.752～0.924)，0.795(0.722～0.875)，0.664(0.596～0.738)，0.882(0.794～0.958)，与对照组(AUC=0.5)比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。miRNA- 10b，SCCA及CEA诊断宫颈癌的最佳截值分别为4.26，6.58 ng/ml，4.05 ng/ml。三项联合诊断宫颈癌的敏感度和特异度较好，分别为84.7%和81.4%。

2.4多元Logistic回归分析血浆miRNA- 10b，SCCA，CEA与宫颈癌的关系见表4。把宫颈癌组与对照组作为二分变量，以miRNA- 10b，SCCA及CEA作为自变量，应用多元logistic回归模型对两组数据进行分析。结果显示，血浆miRNA- 10b和SCCA水平升高是宫颈癌发生的独立危险因素[OR(95%CI)=1.816(1.629～2.483)，OR(95%CI)=1.427(1.206～1.975)]。

表3 血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA对宫颈癌的诊断价值

表4 多元Logistic回归分析血浆miRNA- 10b，SCCA，CEA与宫颈癌的关系

2.5宫颈癌患者血浆miRNA- 10b与SCCA，CEA的相关性见图1。

图1　血浆miRNA- 10b与SCCA，CEA的相关性

Pearson相关分析显示，血浆miRNA- 10b与SCCA呈正相关(r=0.637，P<0.01)；血浆miRNA- 10b与CEA无明显相关(r=0.108，P>0.05)。

3　讨论

宫颈癌的发生是多基因、多因素和多阶段共同作用的过程，其病理机制目前尚不完全明确。微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性非编码的小RNA，在肿瘤生理病理过程中发挥着重要的调控作用，有望成为一种新的疾病诊断、分类和预后判断的工具[4]。已有研究证实，多种miRNA在宫颈癌中异常表达，与宫颈癌的发生、发展、转移及预后密切相关，可作为宫颈癌早期诊断和预后判断的新型标记物[5]。近年来研究发现，血浆miRNA- 10b在多种恶性肿瘤中异常表达，且不同组织来源的恶性肿瘤中表达水平存在明显差异，是诊断恶性肿瘤患者的潜在生物学指标[6，7]。然而，血浆miRNA- 10b能否作为宫颈癌早期诊断的分子标志物，目前尚未明确。

本研究结果显示，宫颈癌组血浆miRNA- 10b，SCCA及CEA表达水平均明显高于CIN组和对照组，而CIN组与对照组无显著差异。在宫颈癌患者临床病理分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血浆miRNA- 10b的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期。说明血浆miRNA- 10b在宫颈癌患者中异常表达，可能通过发挥癌基因的作用来调节宫颈癌的发生发展过程。Hou等[8]研究认为，miRNA- 10b作为miRNA家族中的一员，在宫颈癌患者中存在异常表达，并且与肿瘤的侵袭及远处转移有密切关系。另有研究表明，异常表达的miRNA参与了宫颈癌的发病和进展，可以将miRNA作为宫颈癌新的诊断标志物和生物治疗新的靶点[9]。此外，进一步分析miRNA- 10b表达与宫颈癌临床病理特征的关系，显示miRNA- 10b表达水平与淋巴结转移及浸润深度有关，提示miRNA- 10b在肿瘤预测方面有一定的作用，分析其原因可能是存在淋巴结转移的患者肿瘤负荷往往较大，肿瘤组织可释放更多的具有原癌基因作用的miRNA进入血液，同时可抑制机体原有的具有抑癌作用的miRNA水平表达，进而导致机体miRNA表达水平异常升高；浸润越深的患者病情进展越快，肿瘤组织miRNA表达水平升高越明显。Zou等[10]研究也显示，miRNA- 10b在宫颈癌患者的发生发展过程中具有一定的作用，可能促进宫颈癌患者的进展和转移。

应用ROC曲线分析，结果显示血浆miRNA- 10b对宫颈癌患者的诊断效能明显优于传统肿瘤标志物SCCA和CEA，其最佳截值为4.26，敏感度和特异度分别为82.6%和80.2%；三项联合诊断宫颈癌的敏感度和特异度最好，分别为84.7%和81.4%。相关性分析显示，血浆miRNA- 10b与SCCA呈正相关。说明血浆miRNA- 10b可作为宫颈癌辅助诊断的新型肿瘤标志物，三项联合检测有助于提高宫颈癌早期诊断的准确性。既往研究表明，血浆miRNA- 10b在肿瘤患者中表达升高，是肿瘤预后监测的独立指标，有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物[11]。Parrella等[12]研究也表明，血浆miRNA- 10b在肿瘤预后方面具有一定的临床应用价值，可作为肿瘤治疗的新靶点。本研究中，血浆miRNA- 10b和SCCA水平升高是宫颈癌发生的独立危险因素，而与年龄、病理类型、病理分级、肿瘤大小、绝经状态及CEA水平无关。提示miRNA- 10b可独立作为宫颈癌早期诊断的分子标志物。Saldanha等[13]研究认为，miRNA- 10b在肿瘤患者中异常表达，能成为临床实践中一项新的诊断和预后标志物。Eissa等[14]研究也发现，肿瘤组织中miRNA- 10b的表达变化有助于调控细胞周期调节通路，而细胞通路的激活又抑制其他靶基因，故miRNA的表达模式可作为肿瘤的潜在标志物。另有研究表明，循环miRNA- 10b是检测乳腺癌淋巴结转移的潜在生物标志物[15]。

综上所述，血浆miRNA- 10b在宫颈癌患者中异常表达，有望作为早期诊断宫颈癌的分子标志物，与SCCA和CEA联合应用可提高宫颈癌诊断的准确性。但本研究为单中心的临床研究，其结果可能存在一定的偏差，尚需多中心、大样本的前瞻性研究来进一步验证。

参考文献：

[1]Suh DH，Kim JW，Kang S，et al．Major clinical research advances in gynecologic cancer in 2013[J]．J Gynecol Oncol，2014，25(3)：236- 248．

[2]M’hamed IF，Privat M，Ponelle F，et al．Identification of miR- 10b，miR- 26a，miR- 146a and miR- 153 as potential triple- negative breast cancer biomarkers[J]．Cell Oncol (Dordr)，2015，38(6)：433- 442．

[3]Wang Y，Li Z，Zhao X，et al．miR- 10b promotes invasion by targeting HOXD10 in colorectal cancer[J]．Oncol Lett，2016，12(1)：488- 494．

[4]Shi LX，Zhang L，Wang CY，et al．Expression of serum microRNA- 378 and its clinical significance in renal cell carcinoma[J]．Genet Mol Biol，2017，40(2)：525- 529．

[5]Chen AH，Qin YE，Tang WF，et al．MiR- 34a and miR- 206 act as novel prognostic and therapy biomarkers in cervical cancer[J]．Cancer Cell Int，2017，9(6)：1- 9．

[6]Yang YL，Xu LP，Zhuo FL，et al．Prognostic value of microRNA- 10b overexpression in peripheral blood mononuclear cells of nonsmall- cell lung cancer patients[J]．Tumour Biol，2015，36(9)：7069- 7075．

[7]Liang AL，Zhang TT，Zhou N，et al．MiRNA- 10b sponge：An anti- breast cancer study in vitro[J]．Oncol Rep，2016，35(4)：1950- 1958．

[8]Hou R，Wang D，Lu J，et al．MicroRNA- 10b inhibits proliferation， migration and invasion in cervical cancer cells via direct targeting of insulin- like growth factor- 1 receptor[J]．Oncol Lett，2017，13(6)：5009-5015．

[9]Li M，Li BY，Xia H，et al．Expression of microRNA- 142- 3p in cervical cancer and its correlation with prognosis[J]．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21(10)：2346- 2350．

[10]Zou D，Zhou Q，Wang D，et al．The downregulation of microRNA- 10b and its role in cervical cancer[J]．Oncol Res，2016，24(2)：99- 108．

[11]Wang N，Chen P，Huang LP，et al．Prognostic significance of microRNA- 10b overexpression in breast cancer：a meta- analysis[J]．Genet Mol Res，2016，15(2)：7350- 7359．

[12]Parrella P，Barbano R，Pasculli B，et al．Evaluation of microRNA- 10b prognostic significance in a prospective cohort of breast cancer patients[J]．Mol Cancer，2014，13(1)：142．

[13]Saldanha G，Elshaw S，Sachs P，et al．MicroRNA- 10b is a prognostic biomarker for melanoma[J]．Mod Pathol，2016，29(2)：112- 121．

[14]Eissa S，Matboli M，Shehata HH，et al．MicroRNA- 10b and minichromosome maintenance complex component 5 gene as prognostic biomarkers in breast cancer[J]．Tumour Biol，2015，36(6)：4487- 4494．

[15]Chen WJ，Cai FF，Zhang B，et al．The level of circulating miRNA- 10b and miRNA- 373 in detecting lymph node metastasis of breast cancer：potential biomarkers[J]．Tumour Biol，2013，34(1)：455- 462．