条件培养基对大鼠慢性脊髓损伤后胶质GFAP表达的影响实验研究

张 鹏 吴翠莹 曾 旭 刘 宁 张鹏飞 戴宜武 秦家振

解放军陆军总医院，北京 100700

随着世界各国经济水平的发展，交通工具与城市建设飞速发展，同时带来脊髓损伤的发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是由于外界直接或间接因素导致脊髓损伤，在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常及病理反射等的相应改变，不仅给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还对整个社会造成巨大的经济负担。尤其是慢性脊髓损伤，由于其治疗效果较差，备受各国研究人员的重视。

近年来，随着干细胞技术的发展，干细胞移植治疗 SCI 已成为热点，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）为来源于中胚层间充质的成体干细胞，具有易于获取，无伦理学争议，增殖能力较强，易于体内外扩增等特性，除此之外，MSCs还具有免疫调节，促进神经轴突和血管再生等作用[1-2]。然而，间充质干细胞移植也有诸多不利：如无法长期存活、存在部位无法固定等。而间充质干细胞的条件培养基（BMSC-CM）因含丰富的细胞因子，对多种疾病均有积极的治疗效果[3-4]。

本实验通过观察动物行为学并进行免疫组化学检测得知，BMSC-CM能够在较大程度上影响慢性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达[5]。并对大鼠慢性脊髓损伤后的功能恢复具有重要作用，现报道如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料

随机选取脊髓神经损伤研究实验室84只雄性Wistar大鼠，两组大鼠均为慢性脊髓损伤，依据大鼠的受伤情况并运用随机数字表法将其分为对照组与观察组。对照组与观察组大鼠数量分别为42只，样本来源于受伤后 1、4、11、21、35、60、90d 等不同时期。

1.2　方法

（1）制作慢性压迫性脊髓损伤模型。手术前将大鼠固定在手术架上，并对其注射45mL的戊巴比妥钠麻醉药剂就行麻醉。以T13为中心切口，将大鼠受伤的脊髓进行切除，并将3mm长、0.5mm螺距的塑料钉嵌入大鼠的脊髓，使其脊髓受到10%的压力，之后每隔一天便重复此操作，直至受压程度达到40%，最大的受压程度可达到50%。

（2）BMSCs的培养及BMSC-CM的收集。BMSCs的原代分离培养：使用2%戊巴比妥钠（批准文号：国药准字H31021725，2010-08-17，生产单位：上海新亚药业有限公司）麻醉大鼠，无菌条件取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，暴露骨髓腔，用含青、链霉素的DMEM培养基冲出骨髓，反复吹打；将冲出的骨髓制成单细胞悬液。将冲洗下来的液体制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬离心管中的细胞，镜下细胞计数，使细胞密度达到1×106个/mL，CO2培养箱培养，换液，将骨髓间充质干细胞不断传代、纯化，得到BMSCs。BMSC-CM的收集：纯化后的BMSCs，收集每次换液的培养基，经1500rpm离心去除细胞碎片后，放置与-80℃冰箱保存。

（3） ELISA操作过程（参考厂家试剂盒步骤）。①向96孔板加入100μL×稀释液，作为阴性对照。同时加入所测因子的标准品100μL到96孔板。②将所测样品100μL加到96孔板，每个样品2个微孔。③室温下孵育2h，注意用锡纸包裹96孔板避光。④孵育后将每个孔内的液体吸掉，然后每孔用400μL×冲洗液洗涤4次，每次1 ～ 2min，最后一次时将96孔板翻转置于吸水纸上。⑤每个微孔加入200μL酶标检测抗体，用封板胶纸封住反应孔，室温下孵育2h。⑥孵育后将每个孔内的液体吸掉，然后每孔用400μL ×冲洗液洗涤4次，每次1 ～ 2min，最后一次时将96孔板翻转置于吸水纸上。⑦加入200μL显色底物（显色剂A和显色剂B各100μL），室温下孵育30min，从最后一个微孔加样后开始计时。⑧加入50μL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变成黄色。⑨30min内进行检测，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中生长因子的含量。计算 VEGF， bFGF，TGF-β， HGF， IL-6 的浓度。每个样品重复四次，每组取三个样品。

（4）进行免疫组织化学检测。对切除的脊髓浸泡后进行脱水与石蜡密封工作，当进行免疫组织化学检测工作时，采用SABC法，首先利用浓度为3%的过氧化氢对蜡片进行清洗，以此对蜡片进行杀菌工作；其次将蜡片放入0.01mol/L枸橼酸盐溶液中进行加热，在常温环境下待蜡片冷却后滴入抗原修复液，随后将其放入冰箱中冷藏约8 ～ 10h，将冰箱温度设定为3.5℃。最后，将蜡片从冰箱中取出并加入二抗生物素化羊抗鼠IgG，进行约30min的孵育以此来使脊髓样本中的胶质纤维酸性蛋白恢复活性，加入二氨基联苯胺与苏木素等显色剂在显微镜下进行观察。试验过后利用中性树胶对蜡片进行再次密封。上述采用的所有步骤之间均需使用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行冲洗，并利用PBS代替一抗作为阴性对照。

（5）免疫荧光染色。将切片以 4%多聚甲醛固定 30min。用含 0.3% 或0.1%Triton X-100+10% BSA的 PBS 封闭非特异性染色。然后与一抗（anti-GFAP）4℃孵育过夜。冲洗后加入与一抗相对应的荧光二抗，室温孵育 1h，冲洗。用含 DAPI的封片剂（Vector Lab）封片后，在荧光显微镜下观察、拍照。

1.3　观察指标

（1）观察原代培养的骨髓间充质干细胞的培养及条件培养基情况。（2）观察两组大鼠的免疫组织化学检测结果。（3）观察两组大鼠的组织病理变化。（4）观察两组大鼠的生物行为学变化。

1.4　统计学处理

本次研究的所有数据将被录入至EXCEL中，采用 SPSS13.0 软件进行统计学处理，计量资料应用（x±s）表示，组间比较行t检验，计数资料采用（%）表示，行χ2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

表2　两组大鼠的免疫组织化学检测结果比较（±s ）

表2　两组大鼠的免疫组织化学检测结果比较（±s ）

组别　n　　脊髓损伤前脊髓损伤后1d　4d　11d　21d　35d　60d　90d对照组　42　153.18±18.03　131.87±15.12　120.27±9.82　115.21±13.08　102.37±11.93　114.09±14.21　121.07±13.57　124.58±15.16观察组　42　153.18±18.03　126.04±12.31　（133.24±10.29）　　（135.24±9.06）　　（169.25±9.61）　152.64±12.86　139.24±11.23　114.69±15.41 t 5.909　8.158　28.293 p 0.000　0.000　0.000

表3　两组大鼠的BBB评分比较（分）

2　结果

2.1　原代培养的BMSC-CM中细胞因子含量的检测结果

原代培养的 BMSCs 传至第二代时，细胞形态为长梭形的纤维状，折光性好（图 1）。我们用酶联免疫吸附法测定CM内多种因子VEGF， bFGF，TGF-β， HGF， IL-6的含量，结果如表 1。从检测结果来看，CM中含bFGF（16.51±3.70）pg/mL、VEGF（67.86±6.86）pg/mL、TGF-β（74.23±8.08）pg/mL、HGF（119.72±7.59）pg/mL、IL-6（92.15±6.42）pg/mL等多种细胞因子。

图1　原代培养的骨髓间充质干细胞（标尺为30μm）

表1　Elisa检测骨髓源间充质干细胞条件培养基内分泌的细胞因子含量

2.2　对照组大鼠与观察组大鼠的免疫组织化学检测结果比较

观察组大鼠在受伤后其GFAP平均灰度值便开始上升，在第21d时其水平升到最高值，随后便开始逐渐下降。通过使用BMSC-CM，受伤第90d后其GFAP平均灰度值小于对照组大鼠，同时两组大鼠在受伤后第4，11，21天时GFAP平均灰度值差异较大，具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3　观察组大鼠与对照组大鼠的生物行为学变化比较

观察组大鼠的神经功能恢复时间明显短于对照组大鼠，同时在第11天与21天的BBB评分差异明显，具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.4　对照组大鼠与观察组大鼠的两组大鼠的组织病理变化

对照组大鼠在脊髓受伤后第1天开始，其GFAP含量便开始上升，在进行脊髓压迫手术后，随着时间的延长，其神经元开始逐渐萎缩，并产生炎性细胞浸润现象。然而对于观察组大鼠而言，虽然受伤后第1天的GFAP含量也会上升，但是上升速度却慢于对照组大鼠，同时病变的情况要轻于对照组大鼠，见图 2、3。

图2　对照组大鼠受伤60d后 GFAP表达情况（标尺为25μm）

图3　观察组大鼠受伤60d后GFAP表达情况（标尺为25μm）

3　讨论

脊髓对于任何生物而言都是极其重要的神经组织，一旦受到损伤便会对生物体产生不良影响，因此必须及时采取有效的措施进行治疗[6]。BMMSCs是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，随着研究的深入，MSCs 的旁分泌作用越来越引起大家的关注，大量研究表明，MSCs 分泌的多种因子具有较好的促进创伤愈合和功能恢复的治疗效果[7-8]，其分泌的一些分子已经证明具有抗凋亡和刺激细胞增殖的作用，例如血管内皮生长因子（VEGF）可诱导内皮细胞的增生、迁移，促进血管发生；成纤维细胞生长因子（bFGF）可诱导内皮细胞的增生；转化生长因子（TGF-β）可促进血管成熟；肝细胞生长因子（HGF）可抑制CD4+T细胞增殖，调节免疫；白介素6（IL-6）可调节炎症、诱导VEGF的分泌等[9-10]。BMSC-CM的作用机制主要是通过抑制细胞死亡，减轻炎症反应，促进血管再生而实现对受损组织的修复。

脊髓损伤早期，胶质瘢痕成份主要为小胶质细胞、少突胶质细胞、巨噬细胞和星形胶质细胞等；损伤后期，小胶质细胞、少突胶质细胞和巨噬细胞逐渐被星形胶质细胞所代替，成份较单一[11]。星形胶质细胞的胞体体积较大，多角形，细胞核圆形或卵圆形，由胞体向四周发出几个放射状突起。GFAP是一种酸性蛋白，分子量为50～52KD，属细胞骨骼蛋白，是星形胶质细胞的标志蛋白，其表达的高低可侧面反映星形胶质细胞增殖、肥大、坏死等改变的程度与胶质细胞的功能状态[12]。脊髓损伤后GFAP的表达逐渐增强，其高表达的区域即为胶质瘢痕富集区[13]，本项实验结果表明，通过对观察组大鼠注射BMSC-CM，使得体内的星形胶质细胞的生长得到了抑制，进而在较大程度上降低了GFAP含量，使得大鼠在受伤21d左右便恢复了脊髓组织的正常功能[14]依据研究结果可知，两组大鼠在第21天时BBB评分差距最大，并且随后观察组大鼠的GFAP含量不断降低，因此使得大鼠逐渐恢复健康；同时也在较大程度上为受伤的脊髓神经提供了充足的营养，帮助神经元快速修复[15-18]，能够有效的恢复大鼠的四肢功能，避免留下不良的后果，进而能够有效的提升大鼠的预后质量。除此之外，由于在脊髓受伤后GFAP的含量值上升较慢，也在在较大程度上降低了术后神经元萎缩的速度，进而使得炎性细胞的浸润速度减缓，因而观察组大鼠能够在较短时间内得以恢复。通过上述结果可充分表明，BMSC-CM能够有效的修复大鼠受伤的脊髓组织[19]，并降低慢性脊髓损伤后GFAP的表达量，对于大鼠而言具有重要作用[20]。产生上述结果的总体原因在于GFAP的表达量受到了严重的抑制，因而其含量不断降低，避免了炎症细胞因子的产生，进而缩短了恢复时间。

综上所述，我院认为使用BMSC-CM能够有效的降低大鼠慢性脊髓损伤后GFAP表达量，同时提升BBB评分，进而使受伤大鼠快速恢复健康。通过大鼠实验表明，BMSC-CM对脊髓损伤后功能的恢复，具有重要的临床意义。本次研究样本容量有限，今后仍需大样本随机进一步观察。

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