基于网络药理学预测的芪参颗粒干预过量异丙肾上腺素诱导小鼠心力衰竭的机制研究

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心力衰竭为各种心脏疾病的严重阶段，随着高血压、冠心病等心血管疾病发病率的增加，最终发展为心力衰竭的人群也逐渐增多[1]。虽然西医治疗慢性心力衰竭已取得进展，但存在副作用较大、应用禁忌等问题。中医药具有副作用小及组方灵活等优势，在治疗慢性心力衰竭方面发挥重要作用，值得进一步深入研究。芪参颗粒是研究团队临床长期应用经验方，由黄芪、丹参、金银花、甘草等药味组成，适于心力衰竭阳(气)亏虚、瘀“毒”内阻证，具有“简效验廉”的优势。课题组前期研究表明芪参颗粒对心肌缺血所致心力衰竭模型具有改善心功能、延缓心室重构的作用[2-3]，但其物质基础、作用机制尚未完全阐明。心力衰竭的病理生理机制复杂，交感系统过度激活是其重要机制之一。芪参颗粒是否通过调节交感系统活性治疗心力衰竭，是否对交感系统过度激活导致的心力衰竭有效？为了解答上述问题，本实验拟观察芪参颗粒干预过量异丙肾上腺素致小鼠心力衰竭的疗效，并采用网络药理学方法预测其作用靶点，进一步阐明芪参颗粒作用特点及机制。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级健康C57BL雄性小鼠24只，体重20 g±1 g，购于北京维通利华实验动物中心，适应性喂养3 d，恒温、恒湿，自由饮水，普通饲料。

1.2药物与试剂芪参颗粒由黄芪、丹参、金银花、甘草等中药组成，各药材饮片均购于北京同仁堂制药有限公司，按照课题组前期建立的方法制备[4]。福辛普利(批准文号：国药准字H19980197)由中美上海施贵宝制药有限公司提供。异丙肾上腺素(批号：101722747)由西格玛-奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。

1.3仪器与材料加拿大VisualSonics公司高分辨率小动物超声影像系统Vevo 2100，配有30 MHz探头；1 mL注射器、小鼠灌胃针、1.5 mL离心管、1.0 mL冻存管等。

1.4网络药理学数据库在线中医药生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)[5]。

1.5方法

1.5.1分组与造模小鼠适应性饲养1周后，按照体重随机分为模型组、空白组、芪参颗粒组、福辛普利组。心力衰竭模型制作采用本研究团队经典的盐酸异丙肾上腺素梯度造模法：第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3日～第14日 5 mg/kg给予小鼠皮下注射异丙肾上腺素[6]。给药组和模型组按上述方案，皮下注射异丙肾上腺素。空白组皮下注射生理盐水，每日1次，连续14 d。从造模即日起，福辛普利组每日予福辛普利5.5 mg/kg，芪参颗粒组每日予芪参颗粒44 g/kg(以生药量计)；模型组与空白组动物给予同体积纯净水。连续给药14 d。

1.5.2小鼠心脏超声检测实验终点，采用VisualSonics Vevo 2100小动物高分辨率显微超声成像系统评价各组实验小鼠的心脏结构及功能，测量左室收缩末内径(left ventricular internal systolic diameter，LVIDs)、左室舒张末内径(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)，计算射血分数(ejection fraction，EF)和短轴缩短率(fractional shortening，FS)。每只动物采样3次，记录3个心动周期的平均值用于后续分析。

1.5.3心脏指数计算实验终点，测量小鼠体质量。小鼠腹腔麻醉、处死后，迅速开胸，摘取心脏，用预冷的磷酸缓冲液(PBS)冲洗心腔血块，剪除心脏周围结缔组织和血管，称取心脏重量，计算心脏指数。心脏指数=心质量/体质量。

1.5.4病理学检测心脏组织采用4%多聚甲醛固定，常规乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察并记录病变情况。

1.5.5网络药理学分析在BATMAN-TCM在线网站键入芪参颗粒的组方中药，得到药物治疗疾病与靶点交互数据集。

2　结　果

2.1各组小鼠心功能比较造模后14 d，与空白组比较，模型组LVIDs、LVIDd显著增加(P<0.05)，EF和FS显著下降(P<0.05)。与模型组比较，芪参颗粒组心力衰竭小鼠心室LVIDs显著降低(P<0.05)，有降低LVIDd趋势(P=0.05)，EF与FS提高(P<0.05)。与模型组比较，福辛普利心力衰竭小鼠LVIDd差异无统计学意义(P>0.05)，EF值与FS值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见，芪参颗粒治疗过量异丙肾上腺素诱导的心力衰竭可能较福辛普利更显著。详见表1。

表1　各组小鼠心功能比较(±s)

2.2心脏指数与空白组比较，模型组心脏指数显著增加(P<0.05)；与模型组比较，芪参颗粒组可有效降低心力衰竭小鼠心脏指数(P<0.05)，与阳性对照药福辛普利作用相近。详见图1。

2.3病理学检测HE染色结果显示，模型组动物心肌组织血管管腔、管径增大，血管壁增厚，伴有壁外侧结缔组织增生和炎细胞浸润。与模型组比较，芪参颗粒组动物心肌组织的病变程度显著减轻。福辛普利组也有类似的改善作用。详见图2。

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

图1芪参颗粒对ISO致心力衰竭小鼠心脏指数的影响

图2心肌组织HE染色病理学图

2.4芪参颗粒治疗心力衰竭的靶标预测网络药理学作为系统生物学的研究方法，引入中药复方治疗心血管疾病中，为研究中药复方治疗心血管等复杂疾病的药理学机制和靶点预测提供高通量数据。检索BATMAN-TCM数据库发现，芪参颗粒治疗心力衰竭的靶点共15个，芪参颗粒治疗心力衰竭前10位对应靶点，与心力衰竭经典通路基本吻合。详见表3。

3　讨　论

异丙肾上腺素能增强心肌收缩力，模拟压力超负荷型心力衰竭，具有无创、安全性高、均一性好的优势，在目前心力衰竭动物模型中得到广泛使用。通过本研究发现芪参颗粒可改善异丙肾上腺素致心力衰竭小鼠的心功能，尤其在延缓心力衰竭进程中以心室扩大为主要表现的心肌重塑，能有效减少LVIDs和LVIDd，提示芪参颗粒对交感系统过度激活引起的心力衰竭有较好疗效，调节交感系统可能是其作用机制之一。

运用网络药理学方法观察芪参颗粒治疗疾病的分布情况，将其与相关靶点进行对接，并根据疾病与靶点的相关性推测芪参颗粒治疗心力衰竭可能的机制。计算结果表明，芪参颗粒治疗慢性心力衰竭的作用机制靶点包括血管紧张素转化酶(ACE)、α2型肾上腺素受体(α2-AR)、1型血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体、肿瘤坏死因子(TNF)等。AngⅡ降低，抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)活性、调节交感神经系统、抑制TNF等炎症介质生物合成，改善心功能、逆转心室重构等重要作用环节。

RAS过度激活是心力衰竭发病的启动环节，因此已成为心力衰竭治疗的主要靶点[7]。ACE作为RAS的核心酶 ，催化产生RAS关键的效应因子AngⅡ，发挥血管收缩、细胞增殖、促进心肌重构的作用。AGTR1为1型AngⅡ受体，1型受体认为是调解AngⅡ的主要心血管效应[8]。

α2-AR包括3个高度同源的亚型：alpha 2A 、alpha 2B、alpha 2C[9]。α2-AR通过识别并选择性地与儿茶酚胺类物质特异性结合，引起细胞内信号转导通路激活，调节多种生理和药理反应。交感神经系统和儿茶酚胺类物质对维持心脏生理功能及血压稳态具有重要作用[10]。此外，α2-AR与其相连的胞内效应器调节异常可导致某些心血管疾病的发生，如心力衰竭、心绞痛、心律失常等。

TNF是一个由巨噬细胞分泌多功能促炎细胞因子，其主要通过其受体TNFRSF1A、TNFRSF1B广泛参与规定的生物过程。近年来研究发现，TNF是心力衰竭发生及发展的重要介质，其作用包括抑制心肌收缩功能，促进心肌细胞凋亡，引起心脏重构，从而导致心功能失调与恶化[11]。 因此，芪参颗粒干预心力衰竭机制可能与使AngⅡ降低，抑制RAS活性、调节交感神经系统、抑制TNF等炎症介质生物合成等有关。网络药理学预测结果提示其治疗心力衰竭的作用靶点可能还包括ATP1A1、AVP、GUCY1B3等，体现中药复方多途径、多靶点协同作用的特点。

网络药理学为中药有效成分的筛选及效应机制的研究开辟一条高通量途径，为新药研发及机制探讨提供新的研究思路。但目前网络药理学仍处于起步发展阶段，其研究手段计算方法及应用软件开发有待于完善，基于大数据和算法构建的分子网络及药物靶标网络需进一步实验验证[12]。本研究利用网络药理、经典药理相结合研究路径研究中药复方的药效靶点，为探索中药多靶点治疗病症的机制研究提供方法学参考，但其预测靶点仍需进一步实验验证。

表3　芪参颗粒治疗心力衰竭对应靶点(Top10)

参考文献：

[1] 黄忠恳.慢性心力衰竭治疗进展[J].世界最新医学信息文摘，2016，16(73)：21-22.

[2] 潘月顺，郭力，李彧，等.芪参颗粒联合运动疗法对心力衰竭大鼠心功能及心室重构的影响[J].北京中医药大学学报，2013，36(10)：687-691.

[3] 林阳，仇琪，杨克旭，等.益心解毒方对Ameroid缩窄环致心功能不全小型猪血液流变学的影响[J].北京中医药大学学报，2012，35(2)：112-116.

[4] 冯玄超.从促进血管新生与防止心室重构解释“益气活血”和“益气解毒”法治疗心衰的机制[D].北京：北京中医药大学，2015.

[5] Liu Z，Guo F，Wang Y，et al.BATMAN-TCM： a bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine[J].Scientific Reports，2016，6：21146.

[6] 杨鸣，王达洋，龚嫒媛，等.气阴两虚型心衰病证结合小鼠模型的构建与评价[J].中国中医急症，2015，24(12)：2076-2078.

[7] Teerlink JR.Neurohumoral mechanisms in heart failure： a central role for the renin-angiotensin system[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology，1996，27(2)：S1.

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[9] Hein L，Altman AJD，Kobilka BK.Two functionally distinct alpha 2-adrenergic receptors regulate sympathetic neurotransmission[J].Nature，1999，402(6758)：181.

[10]Wasilewska A，Szewski F，Hudson AL，et al.Fluorinated analogues of marsanidine，a highly α2-AR/imidazoline I1 binding site-selective hypotensive agent.Synthesis and biological activities[J].European Journal of Medicinal Chemistry，2014，87(87)：386-397.

[11]龚开政，董丰，张振刚.肿瘤坏死因子与心力衰竭的最新进展[J].大连医科大学学报，2001，23(3)：215-218.

[12]姜春燕，谭勇，吕诚，等.基于网络药理学预测生地黄治疗银屑病的分子机制[J].中国中医基础医学杂志，2013(4)：404-407.