CD138+与CD138-多发性骨髓瘤细胞生物学特征的研究现状

张先瑞,方美云

(1.大连医科大学附属第一医院 血液科，辽宁 大连 116000；2.大连大学附属中山医院 血液风湿科，辽宁 大连 116001)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种常见的血液系统恶性疾病，以异常增殖的克隆性浆细胞为特征，骨痛、肾衰、贫血等是该病常见的临床症状。随着硼替佐米与来那度胺等新型药物的应用及自体造血干细胞移植治疗的开展，MM患者的生存期明显延长，但是该病的复发率仍将近100%[1]。越来越多的证据表明，MM中存在的能够自我更新与不断分化的肿瘤干细胞(MM stem cell,MMSC)与疾病的高复发率密切相关，针对MMSC的靶向治疗已成为现阶段的研究热点，但是MMSC的表型、起源及其作用机制目前仍不完全清楚。

MM细胞大多表达syndecan- 1(CD138)，CD138是一种对维持细胞形态及其与微环境相互作用等有着重要作用的细胞黏附分子。CD138抗原表达异常与肿瘤细胞增生、侵袭与耐药有关[2]，MM细胞表面CD138低表达是疾病预后不良的重要指征[3]。有2%～5%的MM细胞不表达CD138[4]，既往研究认为，CD138-MM细胞即为MMSC，但近几年的研究发现，CD138+MM细胞也可以克隆源性生长，因此对于MMSC究竟是CD138+还是CD138-细胞目前尚存争议。已知MMSC在具有低分化细胞表型、自我更新与分化能力、耐药与高度侵袭能力同时兼具G1期阻滞及静止表型等特征[5- 6]。作者通过归纳与分析CD138+与CD138-MM细胞相关生物特征的异同及两者间的关联以期进一步探究MMSC的免疫表型、起源与调控机制。

1 CD138+与CD138-MM细胞生物特性的差异及机制

1.1 免疫表型与自我更新及分化能力

生发中心的B细胞受抗原刺激后可分化形成记忆性B细胞与浆细胞，不同分化阶段的细胞具有特定的免疫表型。浆细胞为B细胞分化的终末细胞，B细胞特征性抗原的丢失使得浆细胞表面抗原呈异质性，正常浆细胞与MM细胞表面抗原也有较大差异，CD38++CD138+CD19+CD45+CD56-/CD38++CD138+CD19-CD45-/+CD56+/-是用于区分良恶性浆细胞的主要免疫表型[2]。MM细胞间的免疫表型也存在很大的不同:首先是由MM疾病的异质性决定的，主要表现在MM细胞膜抗原分子CD45、CD56、CD19的表达差异，近期发现有些MM患者还会表达特异性的抗原，如CD81、CD200、CD54等[2]；其次，由于MM疾病的发生发展是一个多步骤、多阶段的过程，因此，MM细胞至少包括4个不同分化阶段的细胞亚群，即记忆B细胞(CD19+CD27+/-CD138-CD38-)、浆母细胞(CD19+CD319+CD38++CD138-)、前浆细胞(CD19-CD319+CD38++CD138-)与浆细胞(CD19-CD319+CD38++CD138+)[7]。

不同免疫表型的MM细胞所具有的自我更新及分化能力不同。Matsui等[4]发现，从MM患者骨髓以及RPMI8226和NCI- H929细胞株中分离出的CD138-MM细胞在体外培养或接种于非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠(non- obese diabetes/severe combinedimmunodeficient，NOD/SCID)体内时，均可克隆生长并分化为MM浆细胞，而CD138+MM细胞却不能够长期增殖。他们进一步研究发现，CD19+CD20+CD27+CD138-记忆B细胞初次和再次植入NOD/SCID小鼠均可致瘤，且去除CD138-MM细胞中的CD20+细胞或CD27+细胞可分别抑制88%与83%肿瘤细胞的生长。因此，Matsui等[8]认为，CD19+CD20+CD27+CD138-记忆B细胞具有干细胞样特征，能够分化为MM浆细胞并可自我更新，进而推测MMSC起源于记忆B细胞。

然而，近几年研究得到了不同的结论。首先，DNA分析证实，CD38++CD19-细胞大多为非整倍体，其典型的细胞周期征象提示CD19-细胞群体中存在大量增殖状态的细胞，而CD19+细胞为整倍体[9]；并且Chaidos等[7,10]将从MM患者骨髓及外周血中采集到的CD19+B细胞或浆母细胞注入NOD/SCID小鼠，结果均未能构建MM模型。其次，Paíno等[11]发现，B细胞特征性抗原CD20仅在RPMI- 8266细胞株中极少量表达(0.3%)，且CD20dim+RPMI- 8266细胞基因表达序列并无Hedgehog、ABCG2等MMSC相关基因的表达，CD20dim+MM细胞自我更新能力甚至不及CD20-MM细胞，由此Paíno等认为CD20也非MMSC的相关抗原。除此之外，若干体内实验均表明CD138+MM细胞也具有克隆源性[7，10，12]。从MM患者骨髓标本中分离的CD138+浆细胞注入NOD/SCID小鼠后可引起MM的表现，并能成功植入第2只小鼠，只是CD138+MM细胞克隆生长速度较CD138-细胞缓慢[9- 10]。基于上述实验结果，目前研究者们更倾向于MMSC起源于浆细胞这一观点。CD138+浆细胞可能由于基因突变失去成熟表型而形成CD138-MMSC[9]；Chaidos等[7]推测MMSC可能是CD19-CD138-前浆细胞；鉴于CD138+MM细胞克隆生长的表现，也有研究者认为MMSC是CD19-CD38+CD138+浆细胞[12]。CD138+与CD138-浆细胞在MM肿瘤起始中的作用及细胞内分子与基因的变化尚需更多研究。

在新近发表的文献中，Johnsen等[12]通过分析CD19+CD27+CD38-单细胞cDNA文库后提出了“多步骤癌变”理论：恶变起始于克隆型记忆B细胞，MMSC的出现经历了一系列分子与基因的改变。基因突变在MM的发生发展过程中起重要作用，在选择压力下出现的“驱动型突变”即可导致MMSC的出现，Johnsen等[12]由此推测MM中可能同时存在不同表型的MMSC。

1.2 侵袭能力

MM具有高度侵袭性，常累及肋骨、椎骨、股骨近端及骨盆等处，超过70%的MM患者体内有循环的恶性浆细胞[13]。MM细胞本身即具有侵犯血管、进入骨髓及系统循环的能力，Chen等[13]在细胞迁移与侵袭实验中发现，CD138-MM细胞穿到Transwell小室下的数量是CD138+MM细胞的2倍，证明CD138-细胞侵袭与迁移能力更强。通过进一步研究，他们认为这与CD138-MM细胞内上调表达的SH3GL3有关。SH3GL3通过磷酸化黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)活化细胞内FAK/PI3K、FAK/Src/RhoA/ROCK与FAK/p38信号通路，促进了CD138-MM细胞的侵袭与转移。

MM细胞与骨髓微环境的相互作用也对细胞转移起着重要作用。骨髓中的内皮细胞、基质细胞及细胞外基质可通过黏附及促血管新生等促进MM细胞的迁移，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)分泌的基质细胞衍生因子(SDF- 1)可形成化学因子浓度梯度诱导MM细胞归巢[14]。同时，MM细胞也可以通过分泌细胞因子或化学因子来调节骨髓微环境以促进自身的转移。Wu等[15]研究发现，CD138-细胞也可以分泌SDF- 1，作用于BMSC表面的SDF- 1受体(CXCR4)从而提高BMSC的细胞僵化程度，而CD138+细胞却无此调节功能。已知肿瘤细胞在僵化的微环境中增殖与迁移力增强[16]，这可能是CD138-细胞具有较强的侵袭力与迁移力的另一机制。

1.3 静息状态

在许多达到完全缓解临床标准的患者体内仍可检测到循环或残留的肿瘤细胞，这与肿瘤干细胞的休眠机制密切相关。处于细胞静止期的肿瘤干细胞对化疗药物不敏感，且可以逃脱机体的免疫监视得以长期存活，在适当的刺激下可以重新进入细胞分裂周期并导致肿瘤的复发。Muz等[6]观察到在低氧环境下CD138抗原表达减少的MM细胞更具干细胞样特征，并且出现G1期阻滞与DNA合成减少的现象。研究者们推测CD138-MM细胞中处于静止期的细胞数量多于CD138+细胞[7- 8]，但是对这一观点目前有争议。

Matsui等[8]发现，几乎所有RPMI- 8226与NCI- H929细胞中的CD138-细胞(>98%)均处于G0～G1期，而仅有72%或77%的CD138+MM细胞处于静止期。Chaidos等[7]也观察到MM患者骨髓样本中处于S期的CD138-前浆细胞数量明显少于CD138+浆细胞。然而，Paíno等[5]却提出了相反的观点，他们用Ki- 67对从RPMI- 8226及NCI- H929细胞中分离出的CD138++与CD138low细胞染色，结果显示这两种不同表型的细胞群中均有25%以上的细胞处于S期或G2～M期，且处于分裂期的CD138low细胞与CD138++细胞的数量并无统计学差异。Lawson等[17]指出，89%处于静止期的5TGM1骨髓瘤细胞都是CD138+细胞，Reid等[18]甚至发现CD38++CD138-细胞的增殖速率比CD38++CD138+细胞更快。以上不同的实验结果可能与MM细胞株种类、细胞培养方式及环境的差异有关。

近期，Yaccoby[1]提出静止性MMSC与增殖性MMSC同时存在，并可在微环境与基因突变、表观遗传调节影响下相互转换这一观点。成骨细胞可维持MM细胞处于静止期，而破骨细胞则可诱导静息状态的MM细胞分裂增殖[17]，细胞状态的相互转换使得CD138-或CD138+细胞群体中同时存在处于静止与增殖期的细胞。

1.4 药物敏感性

耐药是导致MM高复发率与不可根治的主要原因之一，MM的耐药机制包括:(1) 细胞分子遗传学的改变：含ATP结合区的转运蛋白，即ABC转运蛋白(ATP- binding cassette transporters,ABCT)表达升高，细胞药物外排作用增加；对乙醛毒性物质及活性氧自由基具有降解作用的乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性升高；抗凋亡基因与自噬相关基因表达增加等[15- 16]。(2) 骨髓微环境介导耐药：MM患者骨髓微环境可通过细胞黏附与分泌细胞因子等途径支持MM细胞存活与增殖，并能帮助抵抗化疗药物介导的细胞凋亡。

不同表型的MM细胞对药物敏感性不同，多数研究者认为CD138-细胞比CD138+细胞耐药性更强[3，7，19]。Kawano等[3]回顾性分析了90例初诊MM患者与15例复发MM患者的浆细胞表面CD138抗原表达水平，结果发现复发患者CD138-细胞明显增多(29.8%vs.6.6%，P<0.05)。他们进一步研究发现，从同一患者标本中分离出的低表达CD138的KYMM- 1细胞系对来那度胺敏感性较高表达CD138的KYMM- 2细胞系低，且从KYMM- 2中分离出的CD138-细胞也比CD138+细胞更具来那度胺抵抗性。Chaidos等[10]也发现CD138-前浆细胞耐药性是CD138+浆细胞的300多倍。Franqui- Machin等[20]认为这可能与CD138-细胞内的Hedgehog(Hh)信号通路激活有关。与CD138+MM细胞相比，CD138-细胞内SMO和GLi表达增强，而PTCH几乎不表达，提示CD138-MM细胞对Hh配体更为敏感，而活化的Hh信号通路可诱导转运蛋白ABCG2的表达以增强细胞耐药性[20]。CD138-MM细胞内的Hh信号通路受视黄酸受体- α2(retinoic acid receptor alpha2，RARα2)的调控[21]。RARα2在复发的MM患者骨髓中表达升高，在CD138-MM细胞中的表达水平也明显高于CD138+MM细胞。Yang等[21]的研究显示，RARα2不仅可以增强MM细胞ALDH的活性，还能上调细胞内抗凋亡基因Bcl- 2、Bcl- xl与Mcl- 1的表达以减少化疗药物诱导的MM细胞凋亡，针对RARα2的靶向治疗有可能逆转患者对治疗药物的抵抗。

骨髓微环境与MM耐药密切相关。既往研究[22]报道,骨髓龛位(niche)的细胞成分可分泌IL- 6与骨保护素等细胞因子促进MM细胞增殖并抑制凋亡。MM细胞表面上调表达的整合素VLA- 4与龛位黏附以活化细胞中NF- κB信号通路从而介导细胞耐药。CD138+和CD138-MM细胞耐药性的差异是否与骨髓微环境有关目前尚无报道。已知VLA- 4在抵抗性浆细胞中高表达，笔者推测可能CD138-MM细胞表面整合素VLA- 4的表达较CD138+MM多，因此与骨髓龛位黏附作用更强。推论尚需进一步实验证实。

2 CD138+与CD138-MM细胞间的关系

目前，研究者们大多认为具有成熟表型与不成熟表型的MM细胞亚群处于可相互转换的动态平衡之中[1]。Wen等[23]将从初诊的MM患者骨髓样本中分离纯化的CD138-或CD138dim的侧群细胞(side population cell, SP)与CD138+的非侧群细胞(non- side population cell, NSP)细胞培养5个月后发现，两个细胞系并无明显区别，并且NSP细胞去分化得到的SP细胞仍具有MM干细胞的特征，Wen等[23]由此推测不仅CD138-MMSC可以分化成为CD138+细胞，CD138+MM细胞也可以去分化形成CD138-细胞。Chaidos等[7]也发现CD19-CD138-前浆细胞与CD19-CD138+浆细胞之间的相互转换。

为探究CD138+细胞与CD138-细胞相互转换的发生机制，Chaidos等[7]对这两种细胞进行基因测序分析，发现了一些表观遗传调节因子，如SWI/SNF染色质重塑复合物、Polycomb抑制型复合物的成分在CD138-细胞中表达增加，推测CD138+细胞与CD138-细胞间的转换可能受表观遗传调节控制。同时CD138mRNA在CD138+与CD138-细胞中并无区别，CD138抗原表达的差异可能受转录后调控作用影响。Christensen等[24]发现，CD138+MM细胞凋亡时由于蛋白酶裂解作用或蛋白生成减少，CD138抗原丢失形成CD138-细胞。

根据CD138+细胞与CD138-细胞在小鼠模型体内的分布差异[10]以及MM细胞与邻近细胞的密切关系，研究者们推测，CD138+细胞与CD138-细胞的相互转换还受骨髓微环境影响。Fuhler等[25]发现，MM细胞与BMSC共同培养后CD138-细胞含量增多，骨髓基质细胞可通过分泌IL- 6及黏附作用促使MM细胞向低分化表型细胞转换，而间充质干细胞也可通过黏附作用降低CD138抗原的表达。Wen等[23]报道低氧环境下SP细胞比例增加，通过阻断TGF- β1通路可有效抑制低氧诱导的NSP细胞去分化。关于CD138-与CD138+细胞间相互转换机制尚需更多的研究，针对表观遗传调节因子的治疗及诱导具有不成熟表型的MM细胞分化为MM的治疗提供了新的思路。

3 总结及展望

明确MMSC的免疫表型对于推动MM治愈方案的研究有着重要意义，一方面有利于MMSC的分离纯化以便于更深入地研究MMSC形态功能与作用机制，另一方面有利于MMSC靶向治疗的发展。目前研究者们大多认同MMSC源于浆细胞而非记忆性B细胞这一观点，但对CD138-与CD138+浆细胞在肿瘤起始中的作用仍存在争议。CD138+与CD138-细胞间共有291种基因差异表达，因而两者的免疫表型及生物特征差异较大[15]。我们通过分析相关文献发现，与CD138+MM细胞相比，CD138-MM细胞更具干细胞样特征。尽管在细胞自我更新能力与静息状态方面仍有争议，但是CD138-细胞表型低分化且表现出更强的耐药性与侵袭力。多项研究还显示，CD138+与CD138-MM细胞能够相互转换，因此临床中针对CD138+MM细胞的单药治疗并不能取得预期的治疗效果[7]，诱导分化联合CD138-MM细胞靶向治疗可能是未来治疗MM的方向。CD138-MM细胞生物学机制与克隆源性骨髓瘤细胞的免疫表型仍需进一步研究。