一株耐铅菌株NY-3的分离鉴定及其吸附特性研究

张晓青，杜瑾，曹军瑞，司晓光，张爱君，任华峰

国家海洋局 天津海水淡化与综合利用研究所，天津300192

随着经济的快速发展，排放到环境中的重金属离子不断增加。铅是生态环境中常见的重金属污染物之一，铅及其化合物广泛存在于印染、电镀、冶炼、橡胶、纺织等工业废水中[1-2]。铅不仅能通过皮肤接触、饮用进入人体，还可通过食物链传递在生物体内累积，危害人类健康[3-4]。

利用自然环境中耐受微生物处理重金属污染，具有种类多、成本低、安全高效等优势，是目前研究的热点[5-6]。微生物表面存在羧基、氨基、酰胺基等功能基团和活性位点，可以通过氧化还原、甲基化和脱氢作用等方式将重金属离子转化为无毒或低毒的化合物[7]，还有一些微生物可以分泌对重金属具有络合作用的胞外多糖、脂类等表面活性物质[8]。近年来大量研究发现细菌、放线菌、真菌等多种微生物对铅离子具有很好的吸附作用[9-10]，同时还有研究表明非活性菌株对重金属的吸附效果优于活性菌株[11-12]。

我们选取天津滨海近岸沉积物进行耐性优势细菌筛选，通过生理生化实验和16S rDNA 序列对该菌株进行鉴定分析，并考察pH 值、吸附剂投加量、Pb2+的初始浓度、吸附时间等环境变量对菌株吸附Pb2+性能的影响，运用不同模型拟合其生物吸附过程，以期为微生物修复重金属污染环境提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

耐铅菌株分离于天津滨海新区近岸沉积物，经驯化筛选后保藏于本实验室中。原子吸收光谱仪（Analytikjena 公司）；高速冷冻离心机（Sigma公司）；pH 计（Thermo 公司）；全温振荡器（上海苏坤实业有限公司）。

基础培养基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，高磷酸铁0.1 g，陈海水1000 mL，琼脂20 g（固体培养基），pH7.6。

选择培养基：将硝酸铅加入基础培养基中，调节所需要的浓度。

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，水1000 mL，pH7.0～7.2。

1.2 菌株的筛选与分离

称取10 g 沉积物样品于90 mL 无菌水中，空曝4 h，静置后取1 mL 上清液接入Pb2+浓度为100 mg/L 的2216E 液体培养基中，37℃、160 r/min摇床培养1～3 d，培养液变浑浊后，将此菌悬液稀释至10-2～10-6，涂布在Pb2+浓度为100 mg/L 的平板上，于37℃恒温培养箱中培养1～3 d，观察结果。

挑取平板上菌落特征有明显差异的单菌落，继续在Pb2+浓度分别为100、200、300 mg/L 的固体培养基中划线培养，直至获得铅耐受能力最强的单一菌株。纯化后的菌株接种牛肉膏蛋白胨斜面，于4℃保存备用。

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 生理生化特征分析 耐铅菌株进行APT ZYM 19 种酶活、API 20NE 21 项指标、过氧化氢酶、氧化酶等指标测定，方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]。

1.3.2 系统发育学分析 16S rDNA 基因PCR 扩增引物为fd1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和rp2（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，35 个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，送上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。将所测得菌株的16S rDNA 序列与GenBank数据库中已有的16S rDNA 序列进行BLAST 对比分析，利用MEGA5.2 软件构建系统发育树。

1.4 非活性吸附剂的制备

挑取NY-3 单菌落转接到基础培养基中，37℃、160 r/min 恒温培养24 h，10 000 r/min 离心5 min 收集菌体，用去离子水清洗2～3 次，冷冻干燥，研磨过筛，保存于干燥器中备用。

1.5 影响菌株对铅吸附的因素

称取一定量的菌粉添加至100 mL 含不同质量浓度铅的废水中，置于250 mL 锥形瓶中，调节pH 值为3～8、菌体生物量为0.5～4 g/L、金属离子初始浓度为10～300 mg/L，接触时间为0～240 min，25℃、160 r/min 恒温吸附，吸附后10 000 r/min 离心5 min，采用原子吸收分光光度法测定上清液中剩余Pb2+浓度。实验中溶液pH 值用1 mol/L 的NaOH 或HNO3溶液调节。用下式分别计算吸附量（q，mg/g）和吸附率（p，%）：

式中，c0为溶液中Pb2+初始浓度（mg/L），c1为吸附平衡后Pb2+离子（mg/L），V为溶液体积（L），ms为投加吸附剂干重（g）。

2 结果

2.1 耐铅优势菌株的筛选与鉴定

经分离筛选，得到1 株能在Pb2+浓度为300 mg/L 培养基上生长的菌株NY-3。菌株呈黄色，不透明，圆形凸起，边缘整齐，在显微镜下呈粗短杆状。菌株生理生化鉴定见表1、2，菌株能还原硝酸盐和亚硝酸盐，氧化酶和过氧化酶为阳性，精氨酸双水解反应为弱阳性，脲酶反应为阳性，能利用苹果酸、柠檬酸三钠、苯乙酸为碳源。

对菌株NY-3 的16S rDNA 序列进行扩增，通过GenBank 进行同源性比对，建立系统发育树（图1），鉴定该菌为Oceanimonassp.。

2.2 活体和非活性菌株吸附情况

低速离心收集对数生长期菌株NY-3 的发酵液，用去离子水清洗2 次，直接加入100 mL Pb2+浓度为50 mg/L 的废水中；取等量的活体细胞，冷冻干燥后加入100 mL Pb2+浓度为50 mg/L 的废水中，考察活体和非活性菌株的吸附情况，结果见表3。可以看出，NY-3 非活性菌株仍具有对Pb2+的吸附能力，其吸附率还略微高于活体菌株。因此，可以用非活性菌株进行生物吸附研究，克服活体菌株作为生物吸附剂进行废水处理时易受环境因素影响的不足。

表1 API ZYM检测19种酶活

表2 API 20NE检测21项指标

表3 活体和非活性菌株吸附情况

图1 菌株NY-3 的16S rDNA 系统发育树

2.3 pH值对NY-3吸附性能的影响

pH 值能影响生物吸附剂菌体表面结构和重金属离子存在的形态，进而影响吸附剂与重金属离子之间的相互作用，在Pb2+浓度为50 mg/L、NY-3 投加量为1 g/L 的条件下，pH 值对菌株NY-3 吸附的影响见图2。可以看出，pH 值对菌株NY-3 吸附影响作用非常大，随着pH 值的提高，吸附率呈先增加后降低的趋势。pH3 时，Pb2+吸附率仅为2.42%，随着pH 值升高（4～7），菌体表面吸附位点被释放出来，Pb2+吸附率显著升高，pH6 时吸附率和吸附容量分别为94.41%和45.53 mg/g；继续升高pH 值至8，吸附率和吸附量都降低。据此，选择pH6 进行后续实验。

2.4 生物量对NY-3吸附性能的影响

Pb2+初始浓度50 mg/L，pH6，菌株NY-3 投加量分别为0.5、1、2、3、4 g/L，25℃、160 r/min 振荡吸附4 h，结果如图3 所示。当菌体投加量为0～4 g/L 时，随着菌株NY-3 质量浓度的增加，Pb2+的去除率增加，菌体投加量为4 g/L 时Pb2+的去除率达97.07%，而单位菌体吸附量随着生物量的增加而减小，由46.15 降到11.31 mg/g。从图3 还可知，当菌株生物量超过1 g/L 时，吸附率增加不明显，综合考虑Pb2+的吸附率和NY-3 的利用率，菌体的最佳投加量为1 g/L。

图2 pH 值对菌株NY-3 吸附Pb2+性能的影响

图3 投菌量对菌株NY-3 吸附Pb2+性能的影响

图4 金属离子初始浓度对NY-3 吸附Pb2+性能的影响

图5 Langmuir 和Freundlich 吸附等温线

2.5 Pb2+初始浓度对NY-3吸附性能的影响

金属离子浓度是影响重金属生物吸附的一个重要因素，当Pb2+初始浓度为10～300 mg/L，吸附剂投加量为1 g/L，25℃、160 r/min 振荡吸附4 h 的吸附效果见图4。Pb2+浓度低于100 mg/L 时吸附率大于90%，且随着Pb2+浓度增加吸附量增加；继续升高Pb2+初始浓度，吸附率下降，当Pb2+浓度为300 mg/L 时去除率仅为22.3%。

2.6 NY-3对Pb2+吸附的等温模型分析

采用Langmuir 和Freundlich[14]等温吸附模型对Pb2+初始浓度为0～100 mg/L 的吸附过程进行拟合，结果如图5 所示。菌株NY-3 吸附Pb2+Lang⁃muir 等温模型相关系数R2（0.9978）高于Freundlich等温吸附模型（0.9701）等温吸附模型，NY-3 对Pb2+吸附过程更符合Langmuir 等温吸附方程。

2.7 吸附时间对NY-3吸附性能的影响

Pb2+浓度50 mg/L，pH6，NY-3 投加量1 g/L，25℃、160 r/min 振荡吸附4 h，分别测定吸附反应不同时间时NY-3 对废水中Pb2+的吸附效果，结果如图6。NY-3 对Pb2+的吸附是一个快速的过程，最初反应5 min 时吸附率达45.59%，吸附量达23.44 mg/g；60 min 时吸附率为94.16%，吸附量达40.58 mg/g；继续延长吸附时间，菌株表面活性剂位点吸附趋于饱和，吸附率和吸附量增加缓慢。因此，本实验选取最佳吸附时间为60 min。

2.8 吸附动力学研究

通常二价金属离子的生物吸附过程可以用如下二级动力学方程来拟合：

式中，q为吸附平衡时吸附量（mg/g），qt为t时刻Pb2+的吸附量（mg/g），k2为二级反应动力模型的速率常数［g/（mg·min）］。

采用准二级反应动力学模型拟合的结果如图7。结果显示准二级动力学方程可以较好地拟合NY-3 对Pb2+的吸附过程，相关系数达0.9997，q为42.55 mg/g，与实验得到最大吸附量41.38 mg/g接近。

图6 时间对NY-3 吸附Pb2+的影响

图7 NY-3 吸附Pb2+的准二级动力学模型

3 讨论

从天津市滨海近岸沉积物中筛选分离出1 株耐铅菌株NY-3，经生理生化及16S rDNA 鉴定，该菌为Oceanimonassp.。NY-3 非活性菌株对Pb2+具有较高的吸附能力，这可能因为NY-3 是通过菌体表面吸附机制把金属离子固定在细胞表面，与吸附剂生理作用关系很小，菌体的死亡不影响其吸附能力[13]。

由pH 值对吸附Pb2+的影响实验可见，随着pH 值的提高，吸附率均呈先增加后降低的趋势，这可能是在低pH 值时，菌体表面的吸附活性位点被H+和H3O+占据，导致吸附效果较差；随着pH值升高（4～7），菌体表面吸附位点被释放出来，Pb2+吸附率显著升高；pH 值较高时，Pb2+与水中的OH-结合形成沉淀覆盖在细菌细胞壁表面，导致吸附位点减少，阻碍了NY-3 对Pb2+的吸附作用，去除率降低[14]。吸附率随着菌体的增加而增大，这是因为对于特定金属浓度，随着菌体投加量的增加，菌体表面吸附位点随之增加，菌体细胞与Pb2+充分接触，去除率升高，吸附量较高。当菌株生物量超过1 g/L 时，吸附率增加不明显，可能菌体细胞间活性位点相互竞争，吸附活性位点被覆盖，菌体与重金属离子不能充分利用，导致菌体吸附量降低[15-16]。NY-3 对Pb2+的吸附率随着金属离子浓度的增加而降低，这是由于金属离子浓度较低时，NY-3 表面吸附位点没有被Pb2+充分占据，随着Pb2+浓度增加，吸附剂表面吸附位点被占满后，吸附率下降。

等温吸附实验结果表明，菌株NY-3 对废水中Pb2+的吸附能较好地拟合Langmuir 吸附模型，相关系数R2达0.9987，吸附以单层吸附为主，吸附质以单分子形式附着在吸附剂表面；吸附过程可用准二级动力学模型拟合，qm为42.55 mg/g，与实验得到最大吸附量41.38 mg/g 接近。