炎症条件下Ltbp2促进淋巴细胞跨内皮细胞迁移

2018-04-10骈亚亚聂晶晶高振祥胡继红

生物技术通讯 2018年6期

骈亚亚，聂晶晶，高振祥，胡继红

北京医院国家老年医学中心卫生部临床检验中心，北京100730

淋巴细胞是机体参与正常免疫应答及炎症反应的重要功能细胞，而高内皮细胞微静脉（high endothelial venule，HEV）是淋巴细胞向外周淋巴器官运输的主要通道，由高内皮细胞（high endothelial cells，HEC）、壁细胞及细胞外基质组成[1]。正常情况下，淋巴细胞不断地从血液经HEV 进入外周淋巴结等免疫组织，周游全身，起免疫监视和免疫保护作用；特别是在炎症条件下，淋巴细胞能迅速穿过HEC 到达损伤感染部位参与炎症反应，从而维持机体内环境稳定[2]。研究表明，淋巴细胞的大量浸润在某些疾病的发生发展过程中起重要作用，明确其机理对于疾病的防治有重要意义。

淋巴细胞与血管内皮细胞之间存在相互对话，即黏附和迁移。所谓黏附，是指淋巴细胞通过自身受体L-selectin、PSDL-1、MadCAM-1、CD44等与血管内皮细胞表面配体PNAd、P-seletin、E-selectin、MadCAM-1 等结合，继而淋巴细胞被内皮细胞捕获，并附着于内皮细胞，在内皮细胞上滚动、脱落、活化[3-4]。随后，淋巴细胞表面的整合素受体或白细胞功能相关抗原1（LFA-1）及晚期抗原4（VLA-4）与血管内皮细胞上高表达的黏附分子ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 等结合，启动钙离子信号通路，继而引起激动蛋白微丝的收缩，内皮细胞间的紧密连接随之破坏[4-5]。在趋化因子CCL19、CCL21 的趋化作用下，淋巴细胞跨越血管内皮细胞到达各个组织，行驶其免疫监视和免疫保护功能。

本实验室前期通过RNA-seq 方法筛选到一些同时在内皮细胞和胸腺门控内皮细胞上高表达的基因，包括组织内转化生长因子β结合蛋白2（latent-transforming growth factor β-binding pro⁃tein 2，Ltbp2）基因[6]。Ltbp2 是头颈鳞癌预后的重要指标之一[7]，也是一种新型诊断标志物[8]，由肺成纤维细胞分泌的Ltbp2 是一种潜在的特发性肺纤维化生物标记[9]，另有文献报道Ltbp2 能够促进胃癌细胞的迁移和侵袭[10]。然而，在静息状态尤其是炎症条件下Ltbp2 促进淋巴细胞及其亚群跨内皮细胞迁移的机制至今未见研究报道。因此，探讨炎症条件下Ltbp2 促进淋巴细胞及其亚群跨内皮细胞的迁移，有助于深入理解淋巴细胞跨内皮细胞向外周淋巴结的迁移。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用菌株、细胞、质粒及引物如表1 所示，引物合成及序列测序由Invitrogen 公司完成。DMEM 细胞培养基、胎牛血清、青链霉素购自Hy⁃clone 公司；LipofectAMINE 2000 转染试剂、嘌呤霉素购自Invitrogen 公司；BsmBⅠ内切酶、DTT 购自Thermo Scientific 公司；mTNFα、CCL19 购自Peprot⁃ech 公司；流式抗体购自eBioscience 公司；RNA 提取试剂盒购自全式金生物技术有限公司；TaqDNA 聚合酶、实时定量PCR SYBR Premix Ex Taq、T4DNA 连接酶购自大连宝生物工程有限公司；氨苄青霉素购自Sigma 公司；质粒小量提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；基因组提取试剂盒购自北京天为时代生物科技有限公司；Transwell 小室（5 μm）、细胞培养皿及培养板购自Corning 公司；实时荧光定量PCR 仪ABI 7500 购自美国应用生物系统公司；流式细胞仪BD LSRFortessa 购自美国BD 公司。

表1 本研究所用菌株、细胞、质粒及引物

1.2 敲除载体的构建

利用在线网站（http://crispr.mit.edu）设计1 对sgRNA 引物序列。提取CRISPR/Cas9 敲除质粒pu⁃ro_Cas9_empty 用BsmBⅠ酶切并胶回收，sgRNA 于16℃退火后用T4DNA 连接酶连接puro_Cas9_emp⁃ty 和sgRNA，转化大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板，待长出单菌落后挑取单菌落进行菌落PCR。由于切掉的片段为203 bp，而sgRNA 只有20 bp，因此构建的载体比空载体小180 bp 左右，通过核酸电泳和测序即可获得正确的敲除载体。

1.3 敲除细胞系的筛选及鉴定

铺5×104MS1 细胞于6 孔板过夜培养直至细胞密度达到60%左右即可用于转染。将1～2 μg敲除质粒用LipofectAMINE 2000 转染，其中不转染质粒的孔为空白对照，过夜培养后更换为新鲜的DMEM 培养基；用终浓度为2.5 μg/mL 的嘌呤霉素筛选72 h 左右，直至空白对照细胞全部被杀死；胰酶消化剩余细胞，计数并将30～50 个细胞接种至96 孔板，以确保能筛选到单个细胞；单个细胞经1 周培养后，剔除有2 个细胞以上的孔，并转移至48 孔板扩大培养，然后接着6 孔板培养直至长满单层细胞；提取基因组并PCR 测序，将正确的敲除细胞系液氮保存。

1.4 淋巴细胞与内皮细胞黏附实验

铺1×105内皮细胞于48孔板培养24h，用DMEM培养基洗2次，并加终浓度为10ng/mL的mTNFα刺激过夜；用DMEM培养基洗2次，取C57BL/6野生型小鼠腹股沟和腋窝淋巴结，研磨、计数，按内皮细胞∶淋巴细胞为1∶8的比例进行黏附实验，时间分别为6和24h；用DMEM培养基洗3～5次，将未黏附的淋巴细胞全部洗掉；胰酶消化后进行流式细胞分析，根据细胞大小区分内皮细胞和淋巴细胞，并统计淋巴细胞占总细胞的百分比。

1.5 内皮细胞表面黏附分子检测实验

通过实时定量荧光PCR 和流式细胞术分别从RNA 水平和蛋白水平检测内皮细胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 的表达。所用细胞为MS1 细胞和敲除细胞Ltbp2-/-MS1，终浓度10 ng/mL 的mTNFα刺激与不刺激，24 h 后提细胞RNA，逆转录后分别用ICAM1、VCAM1、P-selectin引物进行RT-PCR，HPRT 为内参。同理，24 h 后用胰酶消化内皮细胞，分别用ICAM1、VCAM1、P-selectin 流式抗体观察这些黏附分子的蛋白表达水平。

1.6 Transwell实验

选用5 μm Transwell 小室建立淋巴细胞与内皮细胞的迁移模型。将MS1 细胞和Ltbp2-/-MS1敲除细胞重悬至5×105/mL，并取100 μL 细胞加到Transwell 小室上层，600 μL DMEM 培养基加到小室下层，培养24 h 直至细胞之间形成单层致密紧密连接；DMEM 培养基洗2 次，然后在小室上方加入终浓度为10 ng/mL 的mTNFα刺激过夜，小室下方换成新鲜的DMEM 培养基；DMEM 培养基洗2次，取C57BL/6 野生型小鼠腹股沟和腋窝淋巴结，研磨、计数，按内皮细胞∶淋巴细胞为1∶8 的比例进行迁移实验，即在小室上方加100 μL 4×106/mL 淋巴细胞，小室下方加600 μL 终浓度为20 ng/mL 的趋化因子CCL19，作用6 h 后收集小室下方淋巴细胞，流式抗体染色并上机分析。

2 结果

2.1 敲除细胞Ltbp2-/-MS1的构建及鉴定结果

我们用CRISPR/Cas9 技术敲除C57BL/6 小鼠胰岛内皮细胞MS1 上的Ltbp2基因，最终获得敲除细胞Ltbp2-/-MS1。首先将MS1 细胞Ltbp2基因第1 个外显子上的sgRNA 连接到puro_Cas9_empty 空载体上（图1A），图谱绿色部分标记sgRNA 插入位点，最后经PCR 和测序鉴定。图1B 为核酸电泳，由于切掉片段大小为203 bp，而sgRNA 只有20 bp，因此构建的载体比空载体小180 bp 左右，泳道2～4 是构建成功的阳性克隆。测序结果也证明敲除载体构建成功。通过LipofectAMINE 2000 转染试剂转染MS1 细胞，其中不转染质粒的为空白对照，2.5 μg/mL 嘌呤霉素筛选72 h 左右，待未转染质粒的细胞全部死亡后，分单克隆细胞并逐级扩大培养，提基因组并PCR 测序验证Ltbp2基因的敲除效率，结果如图1C 所示，细胞Ltbp2-/-MS1 缺失2 bp，发生移码突变，证明敲除细胞Ltbp2-/-MS1 构建成功。

2.2 淋巴细胞与内皮细胞黏附结果

在mTNFα刺激下，淋巴细胞黏附MS1 细胞的比例显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，结果如图2所示。图2A 是通过流式术区分淋巴细胞和内皮细胞，图2B、C 分别为淋巴细胞和内皮细胞作用6和24 h 的结果，可见在mTNFα刺激下淋巴细胞与MS1 细胞的黏附显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，且随着mTNFα浓度升高及时间延长体现出一定的量效关系，并且在mTNFα浓度为10 ng/mL时结合达到饱和。该结果充分证明在炎症条件下Ltbp2 促进淋巴细胞与内皮细胞的黏附。

图1 敲除细胞系Ltbp2-/- MS1 的构建及鉴定

2.3 内皮细胞表面黏附分子的表达情况

当淋巴细胞与内皮细胞发生黏附时，内皮细胞会高表达P-seletin、ICAM1、VCAM1 等黏附分子，因此，我们分别从RNA 水平和蛋白水平检测了MS1 细胞和敲除细胞Ltbp2-/-MS1 在mTNFα刺激和不刺激下黏附分子的表达情况，选用mTNFα浓度为10 ng/mL，作用时间24 h，结果如图3。图3A 是RNA 结果，图3B 是流式细胞术检测结果，纵坐标为几何平均荧光强度，可见在mTNFα刺激下ICAM1、VCAM1、P-seletin 的表达量均显著升高，且MS1 细胞表达的ICAM1、VCAM1、P-seletin 显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，证明在炎症条件下黏附分子ICAM1、VCAM1、P-seletin 参与了内皮细胞和淋巴细胞的黏附过程。

2.4 淋巴细胞跨内皮细胞的迁移结果

用Transwell 方法比较了淋巴细胞及亚群穿过MS1 细胞和敲除细胞Ltbp2-/-MS1 的差异。在Transwell 小室上方铺单层细胞MS1 或Ltbp2-/-MS1，然后用mTNFα刺激，并在小室下方加趋化因子CCL19，最后将淋巴细胞加至小室上方，24 h后流式细胞术分析淋巴细胞及亚群穿过MS1 细胞和敲除细胞Ltbp2-/-MS1 的百分比，结果如图4。统计结果发现淋巴细胞穿过MS1 细胞的比例显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，说明Ltbp2基因缺失严重影响了淋巴细胞的跨内皮细胞迁移。我们同时分析了淋巴细胞不同亚群穿过MS1 细胞和敲除细胞Ltbp2-/-MS1 的情况，发现CD4、CD8 T 细胞穿过MS1 细胞的比例显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，而B 细胞并无显著差异，说明CD4、CD8 T 细胞的跨内皮细胞迁移受到Ltbp2基因的影响。

图2 淋巴细胞与内皮细胞黏附结果比较

图3 内皮细胞表面黏附分子的检测

3 讨论

淋巴细胞是机体参与正常免疫应答及炎症反应的重要功能细胞，而内皮细胞是调控淋巴细胞迁入和迁出的重要基质细胞，是通过表达一系列选择素配体、黏附分子和趋化因子来进行调节的。研究表明，向淋巴结迁入的T细胞高表达L-selectin，而外周淋巴结的高内皮细胞则高表达L-selectin的配体PNAd（peripheral node addressin）。PNAd为一系列能和L-selectin结合的硫化、糖基化和唾液酸化的唾液黏蛋白，包括GlyCAM、CD34、sgp200等。在肠系膜淋巴结及派尔结内的高内皮细胞上，则高表达L-selectin另一配体Mad⁃CAM-1[11]。P-selectin和E-selectin也参与T细胞的黏附和迁移，其中E-selectin可介导记忆性CD4+T细胞与活化的血管内皮细胞的黏附。此外，T细胞表面的CCR7与HEV介导的趋化因子CCL19或CCL21接触，使LFA-1发生外翻，随即与黏附分子ICAM-1、ICAM-2或VCAM-1紧密结合，T细胞被紧紧吸附在HEV上[12]。

淋巴细胞跨内皮细胞迁移主要取决于与高内皮细胞微静脉的相互作用。我们实验室前期通过RNA-seq 方法筛选到一些能同时在内皮细胞和胸腺门控内皮细胞上高表达的基因，Ltbp2是其中之一，但Ltbp2是否影响淋巴细胞的跨内皮细胞迁移目前尚无文献报道。我们用CRISPR/Cas9技术构建了Ltbp2基因的敲除细胞株Ltbp2-/-MS1，PCR 及测序结果证明该敲除细胞株构建成功。由于黏附是淋巴细胞跨内皮细胞迁移的前提，因此我们首先进行了淋巴细胞与内皮细胞的黏附实验，发现在mTNFα 刺激下，淋巴细胞对MS1 细胞的黏附能力显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，证明基因Ltbp2能促进淋巴细胞与内皮细胞的黏附。我们接着通过RT-PCR 及流式细胞术比较了MS1 细胞和敲除细胞株Ltbp2-/-MS1 表面黏附分子的表达，发现在mTNFα刺激下，MS1 细胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 的表达量显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，证明黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 参与了内皮细胞和淋巴细胞的黏附过程。最后我们利用Transwell 模型比较了淋巴细胞及其亚群穿过MS1 细胞和敲除细胞株Ltbp2-/-MS1 的差异，发现在mTNFα刺激下，淋巴细胞及其亚群穿过MS1 细胞的能力显著高于敲除细胞Ltbp2-/-MS1，这一结果提示我们Ltbp2基因可能是淋巴细胞跨内皮细胞迁移的关键基因。因此，我们接下来准备研究基因Ltbp2调节淋巴细胞跨内皮细胞迁移的分子机制与功能，比如，Ltbp2可能通过活化酪氨酸磷酸酶SHP2，增强VE-cadherin 的磷酸化水平，导致内皮细胞黏附连接的稳定性降低，从而促进淋巴细胞的跨内皮细胞迁移。我们还可以构建Ltbp2基因敲除小鼠来直接评价Ltbp2对淋巴细胞跨内皮细胞迁移的机制。