2例太岁样品分离菌的初步研究

佟嘉辉，熊向华，汪建华，徐威，张惟材

1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

太岁也称肉芝。明代李时珍著《本草纲目》[1]中对其描述为：“肉芝状如肉，附于大石，头尾具有，乃生物也。赤者如珊瑚、白者如截肪、黑者如泽漆、青者如翠羽、黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也。”太岁样品多发现于土层中[2]，形如肉体，体型较大，表面光滑湿润，颜色多样，至今生物学界对其归类仍未给出明确答案。郑科研等[3]通过研究太岁样本的化学组成，推测其主体为聚乙烯醇，同时含有少量多糖及各种杂菌；朱春玉[4]等则测定了太岁中核酸、多糖、蛋白质等各生物体组成要素含量；西北大学戴璐[5]在对太岁样本的衍生体进行菌分离时共分离得到2种黏菌和18种真菌；王欣[6]从上述同一样本中分离得到35种细菌和1种黏细菌，其优势菌群属β-变性菌纲伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）；林涧等[7]从2例太岁样品中分离得到假丝酵母（Candida）和黏质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。本实验室收集了10余例来自不同地区的太岁样本，着重对其中2例样本的分离菌株进行分子生物学鉴定及分析，以期获得对太岁样品的生物学本质及其组成的初步认识。

1 材料与方法

1.1 材料

黄色太岁（编号YF142）、白色太岁（编号ZWG0525）样品由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态、三氟乙酸（TFA）、7种单糖标准品［葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）］、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；pMD18T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA markers、HifiTaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）购自生工生物公司；甲醇、磷酸、葡萄糖等试剂购自国药集团化学试剂有限公司；引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

Olympus BX-51显微镜（WH 10×/22，100×/ 1.35 oil Iris）；Waters 600高效液相色谱仪；Wa⁃ters Xbridge-C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱。

1.2 太岁样品预处理

太岁样品表面消毒[8]。于超净台中切取块状太岁样品，用75%酒精浸润12 min后用无菌水反复冲洗振荡若干次，回收最后一次冲洗液，取适量涂布于培养基平板上，30℃恒温培养以检测消毒效果。

1.3 太岁样品的菌分离及其分子生物学鉴定

1.3.1 太岁样品分离菌的获取 采用林涧等[7]所述菌株分离法获取分离菌株，涂布于真菌培养基平板上（包括无抗及卡那霉素抗性YPD培养基、无抗及卡那霉素抗性麦芽汁培养基、虎红培养基及沙氏培养基），30℃恒温倒置培养3 d，挑取单菌落平板划线培养。

1.3.2 太岁样品分离菌16S rDNA、18S rDNA、ITS、NS序列测定 50 μL反应体系[7]，以1 μL提取的太岁样品总DNA为模板。16S rDNA PCR扩增条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，循环30次；72℃ 10 min；ITS和18S rDNA扩增条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 90 s，循环30次；72℃10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒切胶回收目的基因后，一部分直接进行测序，一部分连接pMD18T载体，选取阳性克隆后进行测序。将基因序列与GenBank数据库进行Blast比对，确定分离菌株的分类位置。

1.4 太岁样品分离菌多糖组成分析

1.4.1 鞘氨醇单胞菌属发酵多糖分离 YPD培养基于30℃发酵培养72 h后，沸水浴溶解发酵液，12 000 r/min离心10 min提取上清液，加入2倍量的95%乙醇，4℃过夜醇沉，12 000 r/min离心10 min得到分泌的胞外多糖。

1.4.2 多糖样品水解 取1 mL提取的多糖样品置于具塞试管中，加入2 mol/L TFA 2 mL，涡旋混匀，110℃水解8 h，取出冷却至室温，12 000 r/ min离心5 min，取上清，用0.2 mol/L NaOH溶液调pH值至7，将水解液定容至10 mL。

1.4.3 衍生化 准确称取上述7种单糖标准品，配制100 μg/mL单糖标准品溶液及混糖溶液（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖终浓度为50 μg /mL，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖终浓度为5 μg/mL的溶液）；取各单糖标准液、混合糖标准液和样品溶液100 μL置于不同试管中，依次加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和50 μL 0.2mol/L NaOH溶液，涡旋混匀，70℃水浴反应40 min，冷却至室温，加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，用400 μL氯仿萃取，涡旋4 min混匀，4500 r/min离心5 min，取上层水相，重复3次，上层水相经滤器过滤混匀，待用，20 μL进样分析。1.4.4 HPLC分析条件 Waters Xbridge-C18柱，标准液进样量20 μL，样品进样量50 μL，柱温25℃，检测波长250 nm。流动相A为15%乙腈磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH6.9），流动相B为40%乙腈磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH6.9）；梯度模式设置：时间为0→10→30→40 min时，相应浓度梯度为0%→10%→30%→0%流动相B。

表1 扩增引物及序列

2 结果

2.1 太岁样品的形态学观察

编号YF142的黄色太岁样品外观为黄褐色肉质，有弹性，有条纹带，内部成束状并伴有少量白色硬结，表面光滑湿润；编号ZWG0525的白色太岁样品体型较大，外观为白色，有弹性，表面光滑湿润，有类似蕈菌类的伞盖和薄膜，切割时有韧性。见图1。

2.2 对太岁样品中分离得到的4株共性菌的初步研究

对2例太岁样品进行菌株分离，通过培养观察及Blast比对，结果表明2例太岁样品中均含有以下4种原核菌株：TS-1号菌株为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），TS-2号菌株为地中海短波单胞菌（Brevundimonas mediterranea）（其16S rDNA部分序列上传至GenBank，序列号为MF 668251，长度为1331 bp），TS-3号菌株为红串红球菌（Rhodococcus erythropolis），TS-4号为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.）菌株。见图2、表2。

图1 2例太岁样品

2.3 鞘氨醇单胞菌属分离菌的初步研究

图2 分离菌株在无抗性YPD培养基上的菌落形态及显微照片（×100）

表2 对太岁样品中分离得到的4株共性菌的培养观察

文献调研表明，鞘氨醇单胞菌属在生物降解方面具有优势，与太岁较为类似。同时，鞘氨醇单胞菌属可分泌胞外多糖，推测其可能与太岁的形成有关，因此着重对其进行研究。采用鞘氨醇单胞菌特异引物（732 F/982 R）[9]对提取的太岁总DNA进行PCR扩增，得到一条约250 bp的条带，测序结果表明在提取的太岁总DNA中存在鞘氨醇单胞菌基因，并非污染产生。

采用YPD培养基培养TS-4分离菌，30℃发酵72 h后形成黄色冻状物（图3），沸水浴溶解发酵液后，12 000 r/min离心10 min提取上清液，加入2倍量的95%乙醇于4℃过夜醇沉，12 000 r/min离心10 min得到分泌的胞外多糖（图4），通过HPLC对其单糖组成进行分析。

2.4 HPLC分析多糖的单糖组成

混糖标准品PMP衍生后进样梯度流动相HPLC分离结果见图5。鞘氨醇单胞菌属分离菌发酵多糖PMP衍生后进样梯度流动相HPLC分离结果见图6，确认其由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖组成，经标准品峰面积定量后对样品进行分析，其相对摩尔比约为6∶1∶3。

3 讨论

太岁是自然界中存在的一种特殊的未知生命体，至今生物学界对其归类仍未给出明确答案。1992年西北大学对首例太岁样本进行了分析鉴定，认为太岁是一种“特大型罕见黏菌复合体”，并获得一定认可。我们通过微生物学角度研究太岁样本的菌种组成，以期初步了解太岁的生物多样性。采用多种真菌分离培养基对上述2例太岁样品进行菌分离时，从无抗性YPD及麦芽汁培养基平板中分离得到多株相同形态的不同菌株，测序鉴定结果均为细菌，并且2例太岁样品中均含有上述4株菌株。经文献调研，河北师范大学李亮等在NCBI提交的太岁浸液中的29例菌种信息，其中10例为短波单胞菌属，5例为鞘氨醇单胞菌属，3例为假单胞菌属，与我们的结果很相似。结合王朝江[10-11]通过构建16S rDNA文库分析太岁样品细菌多样性的结果，我们认为2例来源地不同的太岁之间可能在生物学组成上存在一定的相似性，也提示不同太岁间存在一定的生物共性。

图3 TS-4分离菌发酵72 h后菌体形成冻状及其显微观察（×100）

图4 TS-4分离菌发酵72 h后分离得多糖及其显微观察（×100）

图5 混糖标准液HPLC分离结果1：甘露糖；2：鼠李糖；3：葡萄糖醛酸；4：半乳糖醛酸；5：葡萄糖；6：半乳糖;7：阿拉伯糖

图6 鞘氨醇单胞菌属分离菌发酵多糖HPLC分离结果

我们发现上述2例太岁样品菌分离得到的菌株均为细菌，并未从中获得真菌，而在对其他较新鲜的太岁样品进行菌株分离时得到了2株酵母，经鉴定其中一株为汉逊德巴利酵母（Debaryo⁃myces hansenii），推测可能是某些太岁样品的组织层较厚不易破碎、真菌含量相对较低或不易在实验室条件下获得并培养、现有分离手段不完善或样品保存条件等原因所致。因此，获取新鲜的太岁样品，对于太岁的研究非常重要。

志谢：江苏靖江太岁金波生物科技有限公司，上海收藏协会太岁传习所陈建平、张网根、朱跃峰、王莉莉为本研究提供了太岁样本，特此致谢！

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