复合镁基磷酸盐骨水泥的研究

张芝祥，杨在君,b，颜红海，丁 祥,c，黄雨裳，周萍萍，黎云祥,c

(西华师范大学 a.组织修复材料工程技术协同创新中心；b.生命科学学院；c.环境科学与工程学院，四川 南充 637009)

不规则的骨缺损和骨损伤一直是当今外科手术的一个难题[1-2]。当前，临床上主要借助骨移植以及骨修复材料填充等方法达到骨修复和重建的目的[3]。尽管骨移植具有良好的生物相容性以及诱导性，但由于来源有限等缺点难以用于大规模的骨损伤修复[4]，因此骨修复材料是解决这一难题的关键。目前，临床上应用较多的具有生物活性的骨修复材料主要是磷酸钙类材料(calcium phosphate cement，CPC)。CPC具有良好的生物相容性和诱导性，并表现出较好的力学性能，然而CPC中的钙磷比过高，导致其在体内降解缓慢且无粘结性[5-6]。

近年来，镁基磷酸盐骨水泥(magnesium phosphate cement，MPC)获得了人们广泛关注。相比CPC，MPC除具有优良的生物相容性和诱导性，还具有较高的起始强度、较快的硬化速度、以及适当的降解速度，且MPC降解过程中释放的Mg2+能够促进成骨细胞生长[5,7-8]。传统MPC主要是镁基磷酸铵盐骨水泥(magnesium ammonium phosphate cement，MAPC)，是通过添加高温煅烧后的MgO和NH4H2PO4做为固相，进一步水化反应生成MgNH4PO4·6H2O[5,8]。这个过程中会释放大量NH3，而体内过量的NH3可能引起较强的细胞毒性，增加机体负担[8-9]。同时，镁基磷酸铵骨水泥凝固时间过快(约3min)[9]，从而限制了其在骨组织修复上的应用。鉴于此，相关研究利用KH2PO4代替NH4H2PO4做为固相合成镁基磷酸钾骨水泥(magnesium potassium phosphate cement，MKPC)取得了较好效果。相比NH4H2PO4，KH2PO4具有较低的解离常数和溶解性，从而降低了反应速率，使凝固时间得以延长[8]。同时反应过程中无可能对机体造成负担的物质产生[9]。然而，KH2PO4代替NH4H2PO4使得制备的水泥起始强度下降[10]，仍然不利于临床上应用。因此，作者尝试通过同时使用NH4H2PO4和KH2PO4作为骨水泥主料合成一种新型生物相容的、可降解的复合镁基磷酸盐骨水泥(composite magnesium phosphate cement，CMPC)，并对合成的复合镁基磷酸盐骨水泥抗压强度、表观形貌、降解能力进行表征，进而探索该复合镁基磷酸盐骨水泥应用于骨组织修复的可能性。

1　材料与方法

1.1　材　料

CMPC固相主要由MgO、NH4H2PO4、KH2PO4、羟基磷灰石等组成。液相为含有NaCl和磷酸盐的磷酸溶液。其中磷酸盐可以中和磷酸溶液，起到pH调节和缓冲作用。MgO购自河北邢台冶金镁业有限公司，NH4H2PO4、KH2PO4购自湖南九典制药有限公司，羟基磷灰石由四川大学生物材料工程研究中心提供。其余试剂均购自成都科龙化工试剂厂。MgO使用前采用1 600 ℃高温进行煅烧从而降低反应活性。煅烧后的氧化镁、以及所使用磷酸盐均采用尼龙筛(300目)进行过筛处理。为探讨复合镁基磷酸盐骨水泥应用于骨组织修复的可能性，选择已上市销售MAPC和MKPC做为参照进行相关性能测试。

1.2　骨水泥样品制备

将制备骨水泥所用固相及液相以0.1～0.5 mL/g的比例进行混合、搅拌成匀浆。待搅拌均匀后，用注射器将骨水泥匀浆注入底面直径为5 mm，高为10 mm的圆柱形玻璃模具中成型，制备细胞毒性测试及生物降解性能测试样品。随后将模具置于37 ℃恒温箱中固化24 h。抗压强度测试样品采用底面直径为6 mm，高为10 mm的圆柱形玻璃模具中成型。为了降低环境温度对实验结果的影响，实验室设置为恒温(25 ℃)。

为了探寻最适CMPC合成配比，本研究采用正交试验，以固化液浓度、氨/钾比例、磷/镁比例作为三个因素，进行三水平正交试验，选择正交表L9(34)安排实验方案(表1)，对结果进行极差分析，确定最适配比条件。

作为对比的市售MAPC和MKPC样品制备参照其使用说明进行配制，并注入底面直径为5 mm，高为10 mm的圆柱形玻璃模具中成型，随后在37 ℃恒温箱中固化24 h备用。

表1　骨水泥正交实验设计

注：体外细胞毒性等级根据GB/T16886.5—2003进行划分。

1.3　体外细胞毒性测试

采用噻唑蓝比色法(MTT)[11]评估CMPC体外细胞毒性。将制备的骨水泥样品称重后置于50 mL无菌离心管中，按0.2 g/mL比例添加RPMI 1 640细胞培养液，随后将离心管置于37 ℃恒温培养箱中静置24 h进行浸提。浸提完成后，取浸提液上清液，过滤备用。将1×104/mL L929细胞悬液(参照GB/T14233.2—2005)接种于96孔无菌细胞培养板，每孔加入100 μLRPMI 1 640细胞培养液，置于CO2体积分数为5%的37 ℃恒温细胞培养箱中培养24 h。培养结束后，弃去培养板内RPMI 1 640细胞培养液，加入200 μL样品浸提液。空白对照则加入等体积的RPMI 1 640细胞培养液。随后置于恒温细胞培养箱中(37 ℃，CO2体积分数5%)培养24 h。每个样品重复6次。细胞培养结束后，取出细胞培养板，弃去培养板内样品浸提液，于每孔中加入100 μL含血清10%的RPMI 1 640细胞培养液，同时加入1 mg/mL MTT染色剂50 μL，随后再次置于上述细胞培养箱内培养3 h。培养结束后，弃去孔内液体，加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，检测570 nm波长下样品吸光度。按以下公式计算相对细胞增殖率，相对细胞增殖率=(实验组吸光度值/空白组吸光度值)×100%。同时，观察细胞在各组中生长情况及形态变化。

1.4　骨水泥性能测试

细胞毒性测试完成后，根据GB/T16886.5—2003对细胞毒性的等级划分，对无毒样品(毒性等级为1或0级)的抗压强度、表观形貌、降解能力进行表征，并选择市售MAPC和MKPC做为参照进行对比。

1.4.1骨水泥组成及形貌特征分析

骨水泥组成采用X衍射(X-ray diffraction，XRD)分析。将骨水泥样品碾碎，采用“压片法”制成试片上机分析。X射线衍射分析在Dmax/UItima IV型X射线衍射仪(日本理学公司)上完成。通过对样品衍射图与PDF卡片对比得到样品组成。骨水泥样品形貌特征通过扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)进行分析。分析前，将骨水泥样品制备成薄壁方块状试样，在横截面镀金，随后利用JSM-6530LV型扫描电镜(日本理学公司)进行分析。加速电压和加速电流分别设定为5 kV 和10 μA。

1.4.2抗压强度测试

将制备的骨水泥样品置于水温37 ℃、100%湿度的恒温水浴锅中水化24 h。取水化后的试样，将其两段磨平，平衡度误差0.01 mm。随后利用MTS E44.104型微机控制电子万能实验机进行抗压强度测试，加载速度设置为1 mm/min。每个样品重复3次。

1.4.3生物降解性能测试

将骨水泥样品称重后置于塑料瓶中，并按200 mL/g比例添加Tris-HCl溶液(pH 7.4)。随后将塑料瓶放置在37 ℃恒温水浴摇床上(100 r/min)连续培养。每隔7d将骨水泥样品取出，用去离子水清洗骨水泥样品，置于120 ℃烘箱中烘干至恒重称量并记录，随后置换新的Tris-HCl进行培养。骨水泥样品降解率按如下公式进行计算：降解率(%)=(初始重量-剩余重量)/初始重量×100%。为了比较不同骨水泥不同时间段的降解速率，以7 d作为一个周期，计算周降解率。周降解率计算公式为：周降解率=每周降解骨水泥重量/骨水泥样品初始重量×100%。

2　结果分析

2.1　影响镁基磷酸盐骨水泥细胞毒性的因素

观察各组细胞生长状况(图1 A-J)发现，加入编号为1、4、5、9骨水泥样品浸提液的细胞大量圆缩(图1A、D、E、I)，加入编号为2、3、6、8骨水泥样品浸提液的细胞大量破裂死亡(图1B、C、F、H)。加入编号为7骨水泥样品浸提液的细胞生长良好(图1G)，细胞呈梭形且饱满，与空白对照(图1J)组细胞生长情况相似。利用MTT法对不同用料配比骨水泥的细胞毒性进行评估，并依据GB/T16886.5—2003分类标准对骨水泥样品细胞毒性进行等级划分(表1)，结果表明，除7号骨水泥样品为无毒级外(相对细胞增殖率为97.55±4.06%)，其余样品均表现为一定的细胞毒性。进一步对相对细胞增殖率结果进行极差分析(表2)，结果表明骨水泥中磷/镁比例对骨水泥细胞毒性影响最大，固化液浓度次之，氨/钾比例对骨水泥细胞毒性影响最小。具有最好生物相容性的骨水泥制备条件为固化液浓度为15%、氨/钾比1.5、磷/镁比为1.0。

2.2　XRD及SEM分析

进一步对CMPC样品以及市售MPC的组成和形貌特征进行表征。XRD结果表明(图2)，MKPC主要生成MgKPO4·6H2O，MAPC主要产物为MgNH4PO4·6H2O，而CMPC中包含上述两种产物。同时，可以看出，MgKPO4·6H2O和MgNH4PO4·6H2O具有重叠的衍射峰。此外，三种骨水泥中均检测到MgO的衍射峰，表明有大量未完全反应MgO存在。SEM扫描分析(图3)展示了三种不同骨水泥截面形貌。MKPC表面呈块状且有大量圆形微孔和裂隙，放大扫描倍数发现，骨水泥呈表面覆盖小颗粒的球形(图3A)；MAPC表面光滑，存在大量微小裂缝，扩大扫描倍数发现，这些微小裂缝中存有大量微小球形颗粒(图3B)；CMPC表面光滑有圆形微孔，进一步扩大扫描倍数发现，微孔中有着大量微小球形颗粒(图3C)。

表2　CMPC体外细胞毒性极差分析

项目液相浓度/%镁/磷氨/钾K1-3131.57170.51166.11K4-6157.6186.140145.18K7-9183.75216.29162.19R17.39043.2906.9800

注：Ki为表1对应的各因素同一水平下每三组

试验细胞相对增值率之和。

2.3　抗压强度

对三种骨水泥的抗压强度进行测试。结果表明(表3)，MKCP的抗压强度最高，达到19.0±5.0 Mpa，CMPC的抗压强度次之，为9.3±1.7 Mpa，MAPC的抗压强度最低，仅为4.6±0.5 Mpa。

表3　三种镁基磷酸盐骨水泥抗压强度

2.4　生物降解性能测试

对三种不同骨水泥生物降解性能进行测试。连续培养三周后，三种骨水泥的降解率均超过90%(表4)，培养至第四周时，已经完全降解。进一步分析发现，经过一周培养后，MKPC降解速率最快，为43.89%，CMPC次之，为36.66%，MAPC降解速率最慢，为25.67%；二周后，CMPC和MAPC降解速率仍然较快，分别为32.23%和32.42%，而MKPC降解速率有所下降，为22.01%；三周后，CMPC降解速率最快，达到45.26%，而MAPC和MKPC降解速率与上周基本持平，达到平衡，分别为32.72%和24.20%。

表4　三种镁基磷酸盐骨水泥生物降解性能

3　讨　论

良好的生物相容性是骨水泥应用于临床的首要条件。作者采用不同的骨水泥用料配比和极差分析，结合细胞形态观察分析了影响复合镁基磷酸骨水泥生物相容性的因素。结果表明(图1，表2)，磷/镁比是影响骨水泥生物相容性的首要因素。研究表明，镁基磷酸骨水泥中的主要化学反应为：MgO+ KH2PO4(NH4H2PO4)+5H2O→MgKPO4·6H2O(MgNH4PO4·6H2O)[8]，反应过程中过多的磷酸盐或氧化镁会导致机体局部磷或镁离子浓度过高，从而对机体产生毒害，使细胞不能正常生长[12]。研究结果也表明磷/镁比为1.0时细胞具有最好的相对增殖率，这也证实了过多的磷或镁离子可能不利于细胞生长，从而影响组织愈合。

为了进一步探讨制备的骨水泥在组织修复上应用的可行性，作者根据细胞毒性结果对无毒的骨水泥样品的抗压强度、表观形貌、降解能力进行了表征，并选择市售镁基磷酸盐骨水泥进行对比。XRD结果表明，MKPC的主要产物为MgKPO4·6H2O，而MAPC的主要化学产物为MgNH4PO4·6H2O，这与前人的研究结果一致[8]。本研究合成的CMPC则检测到上述两种产物的衍射峰，说明CMPC中同时发生了这两种主反应。研究表明，MgKPO4·6H2O与MgNH4PO4·6H2O具有相似的晶体结构[13]。本研究中，XRD结果显示MgKPO4·6H2O与MgNH4PO4·6H2O衍射峰发生重叠，这再次证实了二者在晶体结构上的相似性。从抗压强度来看，MAPC的抗压能力最差，MKPC的强度最高，而本研究制备的CMPC抗压强度居中。从SEM扫描结果(图4)可以看出MAPC表面存在许多微孔，这些微孔可能是在化合反应中生成的氨气逸出产生，致使骨水泥致密度变低，从而影响抗压强度。值得注意的是，三种骨水泥中抗压强度均低于30 MPa，仅能用于非承重骨修复[14]。有研究表明，MPC的抗压强度主要由水化物和水泥石生产量决定，随着MgO含量的增加，骨水泥的强度随之增强[6]，镁/磷摩尔比为4～5时，骨水泥强度最高[15]。然而，过量的Mg2+会增加骨水泥的细胞毒性，因此如何增加骨水泥强度而保持良好的生物相容性是骨水泥进一步应用于承重骨修复的关键。进一步对三种骨水泥的生物降解性能进行测试，结果显示三周后三种骨水泥的生物降解率均超过90%，这表明这三种骨水泥均具有良好的生物降解能力。MAPC前期生物降解速度较慢，MKPC前期降解速度则较快，而CMPC的前期降解速率居中，这可能与骨水泥的组成相关。三种骨水泥在后期的降解速率则变化不大，表明达到某种平衡。这些结果说明可以通过选择不同磷酸盐及磷酸盐组合作为骨水泥的磷酸盐组分，从而合成具有不同初始降解速率的骨水泥材料，进而满足不同的临床要求。

综上所述，通过同时添加NH4H2PO4和KH2PO4作为骨水泥磷酸成分，成功合成一种新型的骨水泥材料。通过正交设计研究了不同骨水泥组分对骨水泥生物相容性的影响，结果表明，磷/镁比对骨水泥的体外细胞毒性具有重要影响，因此，在进行骨水泥制备时，要重点考虑磷/镁比例。通过与市售MPC比较，本研究合成的新型骨水泥具有良好的生物相容性、优良的生物降解性能、以及较好的抗压强度，有望应成为一种新型的骨组织修复材料。

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