GeneXpert MTB/RIF在新发活动性肺结核诊断 及对利福平耐药快速检测中的应用价值

高阳　宋其生　周洁　张冬　王心愿　安东成

结核病是严重危害人类健康的全球公共卫生问题。耐药结核病已经成为全球结核病疫情急剧上升的原因之一。据WHO 报道，目前我国仍为结核病高负担国家之一[1]。全国第五次结核病流行病学抽样调查资料显示，我国耐多药结核病占6.8%[2]。目前我国结核病防治机构(简称“结防机构”)诊断活动性肺结核检测技术主要是痰涂片和痰培养，痰涂片的阳性检出率较低，而固体培养耗时过长，均不能满足临床诊疗的需求。GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)检测依据半巢式实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)原理，针对MTBrpoB基因81 bp利福平耐药区间设计引物和探针，检测其是否发生突变。Xpert检测技术简单、快速、安全、自动，能同时检测MTB及是否对利福平耐药[3]，得到广泛关注与认可[4]。本研究收集大连市结核病医院临床就诊的378例肺部疾病患者，探讨Xpert检测在新发活动性肺结核特别是涂阴肺结核的快速诊断及利福平耐药快速检测中的应用价值。

对象和方法

一、研究对象

收集2015年6月—11月大连市结核病医院临床就诊的378例肺部疾病患者。临床按照《肺结核诊断标准(WS 288-2008)》[5]，且经过抗结核药物治疗有效证实，268例患者诊断为新发活动性肺结核，其中涂阳79例，涂阴189例；男165例，女103例；年龄9～89岁，平均年龄(42±15.32)岁。其余110例患者排除肺结核，其中8例为非结核分枝杆菌(NTM)肺病，不在本次研究之列；其他肺部疾病102例患者中，男60例，女42例，年龄11～81岁，平均年龄(47±16.85)岁；肺炎68例，肿瘤11例，间质性肺病4例，支气管扩张15例，慢性阻塞性肺病4例[6]。

二、研究方法

1.标本留取：每例入选患者均收集即时痰、夜间痰及晨痰标本3份(每份样品量在 3～5 ml)。分别进行痰涂片、固体培养和Xpert检测。

2.检测方法：3份痰标本均进行萋-尼染色；若痰涂片结果为阳性，取阳性痰1 ml用作 Xpert检测结核分枝杆菌和利福平耐药性；若痰涂片结果为阴性，取痰标本1 ml用作Xpert检测结核分枝杆菌和利福平耐药性。每例患者的3份痰标本均进行分离培养，培养阳性菌株进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。

具体方法如下：(1)痰涂片按照文献[7]中萋-尼染色法相关要求进行涂片、染色、镜检并报告结果。(2)固体培养按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[8]中的相关要求，取适量痰标本加入等量的4%氢氧化钠，振荡静置20 min，用无菌吸管吸100 μl接种到酸性罗氏培养基上，置于37 ℃培养箱中孵育。每周观察结果并及时报告，若满8周仍未有菌落生长，则报告培养阴性。(3)比例法药敏试验按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[9]中的相关要求，取培养基上的菌落，制备1 mg/ml菌悬液，并分别稀释成浓度为10-2mg/ml、10-4mg/ml的菌液；取0.01 ml的10-2mg/ml和10-4mg/ml菌液，接种至含利福平(40 μg/ml)的中性罗氏培养基和空白对照培养基上，37 ℃培养4周后报告结果。若耐药百分比(耐药百分比=含药培养基的菌落数/对照培养基的菌落数×100%)>1%则判定为耐药。(4)Xpert检测按照Xpert操作说明书进行操作。①前处理：取1 ml痰入管中，加入痰2倍体积的样本处理液，振荡20 s后，静置15 min。用专用吸管取2 ml处理后的样液从反应盒的加样孔缓慢加入其内。②检测：开启Xpert仪和电脑，待自检通过后，将反应盒放入模块中，系统自动进行核酸提取、扩增，目标序列的检测和结果判断。③结果判读：Xpert检测对MTB的结果分为“MTB检出”和“MTB未检出”。Xpert对利福平耐药的检测结果分为“利福平耐药检出”和“利福平耐药未检出”。

三、仪器与试剂

MTB染色液、酸性和中性罗氏培养基、药敏试验培养基及对硝基苯甲酸(PNB)培养基，均购自珠海贝索生物技术公司。Xpert检测系统及其配套试剂盒由美国Cepheid公司生产，原装进口。

四、统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析。敏感度、特异度等计数资料的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。一致性比较采用Kappa检验，Kappa值≥0.75认为两者一致性较好。

结　　果

一、基本情况

268例临床确诊肺结核的患者中，涂片阳性79例，固体培养阳性117例，Xpert检测阳性149例。189例涂阴肺结核患者中，固体培养阳性38例，Xpert检测阳性70例。102例非肺结核患者中，固体培养阳性1例，Xpert检测阳性2例。

二、检测效能比较

1.三种方法对于活动性肺结核的检出率：268例临床确诊肺结核的患者中，涂片阳性79例，固体培养阳性117例，Xpert检测阳性149例，阳性检出率分别为29.5%(79/268)、43.7%(117/268)、55.6%(149/268)。三种方法比较差异有统计学意义(χ2=37.41，P=0.000)。

2.涂阴肺结核患者采用固体培养和Xpert检测的阳性率比较：189例涂阴肺结核患者中，固体培养阳性检出率为20.1%(38/189)；Xpert 阳性检出率37.0%(70/189)。二者比较差异有统计学意义(χ2=13.27，P=0.000)。

3.传统培养和Xpert检测在活动性肺结核中的检测效能：以临床诊断为标准，固体培养检测结核病的敏感度为43.7%(117/268)，特异度为99.0%(101/102)，阳性预测值为99.2%(117/118)，阴性预测值为40.1%(101/252)；Xpert 检测结核病的敏感度为55.6%(149/268)，特异度为98.0%(100/102)，阳性预测值为98.7%(149/151)，阴性预测值为45.7%(100/219)(表1)。固体培养与Xpert检测的敏感度比较，差异有统计学意义(χ2=7.64，P=0.006)；特异度比较，差异无统计学意义(χ2=0.00，P=1.000)。

三、比例法与Xpert检测对利福平是否耐药的结果分析

在固体培养和Xpert 检测均阳性的113例肺结核患者中，其中比例法检测结果为耐药的11例中，Xpert检测结果为耐药的有10例、敏感的有1例；比例法检测结果为敏感的102例中，Xpert检测结果为敏感的有101例、耐药的有1例。Xpert与比例法药敏试验利福平耐药一致性比较，Kappa值为0.899，说明两种方法结果具有很好的一致性。

讨　　论

结核病的早期诊断和耐药性检测对于结核病防治工作意义重大。我国结核病传统的实验室诊断方法有涂片镜检和分枝杆菌培养等。涂片法简单、快速，但敏感度不高。培养法是检测MTB的“金标准”，耗时较长，需要6～8周，敏感度相对于涂片法有所提高。本研究结果显示，活动性肺结核的痰涂片和传统法培养的阳性检出率分别为29.5%和43.7%，与既往研究结果接近[10]。近年来一些新型的分子生物学检测技术(如环介导等温扩增技术[11-12]、线性探针技术[13]、Xpert技术[3]等)得到认可。而Xpert法有其独特的优势，整个检验过程只需2 h，该方法快速、简便，能同时检测MTB及是否对利福平耐药；封闭的反应系统，对生物安全要求相对较低，最大程度地减少了操作中污染的可能性。

有报道Xpert技术的临床检出限为131 CFU(菌落形成单位)/ml[14]，抗酸染色镜检检出限为5×103CFU/ml以上，培养为10～100 CFU/ml[15]。本研究268例肺结核患者标本同时采用痰涂片、固体培养及Xpert检测，以Xpert法检出率最高，其次为培养法，抗酸染色法的阳性检出率最低；涂阴标本Xpert阳性率高于固体培养阳性率。本研究结果显示，Xpert检测涂阴肺结核患者的价值与陈子芳等[16]的研究结果相同，优于张志学等[17]的研究，进一步证实Xpert法临床应用价值高于传统涂片和固体培养，能够更好地辅助临床对肺结核患者特别是涂阴肺结核患者进行早期诊断和治疗。

2010年，在南美洲、非洲和亚洲结核病实验室的多中心评估结果表明，相对于培阳、涂阳标本，Xpert检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为92.2%和98.2%[18]。张治国等[19]研究以固体培养为金标准，Xpert检测MTB的敏感度为95%，特异度为89.6%。李辉等[15]研究以固体培养为金标准，Xpert检测MTB的敏感度为91.93%，特异度为95.55%。以上研究都是以传统固体培养作为金标准对Xpert进行检测效能评价，不可避免会漏诊很多经气管镜或病理活检等检查诊断的肺结核患者。而本研究以临床诊断为标准对传统培养和Xpert法进行诊断价值评价，能够更加全面客观反映其对肺结核患者诊断的临床价值。本研究显示固体培养检测结核病的敏感度为43.7%、特异度为99.0%，而Xpert检测MTB的敏感度为55.6%、特异度为98.0%。结果表明，Xpert检测可大大提高活动性肺结核的诊断率、缩短诊断时间。

表1　268例临床诊断为活动性肺结核患者采用固体培养和Xpert检测结果的比较

注敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%

利福平作为重要的抗结核药物，被世界卫生组织推荐为治疗结核病的一线药物，但耐利福平结核病危害严重。由于MDR-TB的治疗时间长、治疗费用昂贵、治愈率低，已成为结核病控制的重大难题，快速诊断MDR-TB对结核病防控意义重大，所以Xpert法与线性探针技术[13]等快速检测利福平、异烟肼耐药的技术受到关注。本研究结果显示，与比例法药敏试验结果相比较，Xpert法具有极好的一致性。该结果与李妍等[20]、牛海军等[21]的报道相近。由于大部分利福平耐药株同时对异烟肼耐药[22]，故在利福平耐药的情况下，一定程度上可以作为MDR-TB的筛查和监测指标。世界卫生组织建议，如果将Xpert检测应用于利福平耐药患病率较低的人群进行耐药诊断，对利福平耐药阳性结果需要进行重复实验[23]。本研究证实，进行一次Xpert 检测对利福平是否耐药就可达到与传统比例法药敏试验结果的高度一致性。如果不需要对利福平耐药阳性结果需进行重复实验，将提高MDR-TB的诊断速度，降低MDR-TB的检测成本。这个问题值得继续探讨。

总之，Xpert法简便、快速、安全，是敏感度、特异度都较高的分子生物学方法，并且能够快速诊断新发活动性肺结核及利福平耐药，特别是对快速诊断涂阴肺结核有较大价值，应该引起足够重视。其主要不足是：Xpert 需要配套价格昂贵的仪器及成本较高的试剂才能实现对结核病和对耐利福平结核病的检测；另外，该方法只能检测是否对利福平耐药而不能同时检测是否对异烟肼耐药[24]。

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