抗菌肽的生产方法与产业化分析

　

(河南牧业经济学院，河南 郑州，450011)

抗菌肽是存在于生物体内由13-45个氨基酸组成的小分子多肽，能消除体内突变细胞，抵抗外界微生物侵害，属于先天免疫系统的重要组成部分。目前为止，人类已经发现了两千多种抗菌肽，这些抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物、哺乳动物(包括人)[1]中，它们具有广谱杀菌、抑病毒、抑真菌和抑杀肿瘤细胞等活性，而且不破坏人体正常细胞，能增强免疫功能，加速伤口愈合，在医药、食品加工、日化、农业、畜禽养殖业等方面应用前景可观。

1　抗菌肽的生产方法

1.1　生物提取法

抗菌肽的传统分离方法主要是通过人工诱导刺激生物有机体内抗菌肽的产量，再用生物化学方法将抗菌肽从宿主机体中提取分离出来。这种传统分离提纯方法非常繁琐，受其来源的限制，提取量较少，而且不同的试验条件对于组分的活性效果影响很大，生产成本较高，不能满足规模化生产的需要。

1.2　化学合成

已知氨基酸序列的抗菌肽，采用化学合成法获取目标多肽。目前，有液相合成、固相合成、片段法合成和化学合成四种方法。液相合成法较为基础，但由于中间体提纯过程复杂，工作量较大，花费时间较长，故而使用较少,现多采用多肽的固相合成技术结合化学技术。

固相合成法是根据组成肽链的氨基酸分子结构，从C端(羧基端)向 N端(氨基端)重复添加氨基酸的过程。1963年Merrineld首次发明使用，通过固体树脂(PAM，MBHA，Rink．Amide-MBHA等)载体上的化学基团与所合成的肽链氨基酸C端以共价键的形式相连接，再以结合在固相载体上的氨基酸N端作为起点，同连在树脂上的氨基端进行连接反应。脱去氨基保护基并同过量的活化羧基反应以延长肽链，连接一个氨基酸，再脱去氨基保护，再接下一个氨基酸，通过重复以上过程，就可以得到所需要的肽段。组合化学法又称为同步多重合成化学或组合合成化学，是以固相合成为基础建立起来的，运用化学合成、组合理论 、计算机辅助设计和机械技术，可在短时间 内将购买的或合成的不同结构的基础模块，通过化学合成或生物合成，以共价键的形式相结合，系统反复进行连接，从而产生大批相关的化合物。组合化学法是近几十年兴起的一门新学科，已成为化学领域最活跃的部分之一。

1.3　基因工程表达

生物提取法费时费事、产量低；化学合成法所需时间较长，人工合成成本过高，多用于合成较短的肽段，且多为线性，不具备复杂的二级结构，不能保证合成的抗菌肽具有正确的空间构型而具有生物活性。随着技术和设备的改进，基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理论和实践上已成为可行的途径。目前，基因克隆和表达抗菌肽基因，越来越受到人们的重视。

当前常见的抗菌肽表达体系有真核和原核表达体系两种。在原核表达体系中，以大肠杆菌表达体系、芽孢杆菌表达体系为代表；酵母表达体系在真核表达体系中使用最多。近年来，真核微藻表达系统因其成本低、产量高的特点得到业界的广泛关注。

1.3.1大肠杆菌表达系统

目前，大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、应用最为广泛的表达系统，具有遗传背景清楚、表达水平高、操作简单、培养周期短、抗污染能力强等优点，但因抗菌肽对细菌的杀伤作用，而原核表达缺乏蛋白质翻译后的修饰和加工过程，所以抗菌肽基因只能以融合蛋白形式表达。

1.3.2枯草芽孢杆菌表达系统

枯草芽孢杆菌表达具有以下三个特点：第一、枯草芽孢杆菌是非致病性革兰氏阳性菌，细胞壁组成简单，不含内毒素，能形成芽孢；第二、细胞壁能将大量的蛋白质分泌到胞外，回收和纯化都较为简单；第三、枯草芽孢杆菌拥有高效的分泌信号肽系统，能完成目的蛋白的高效分泌表达，避免包涵体的形成。由于这些特点，因而成为工业酶制剂的重要生产菌，并已在芽孢杆菌中得到水解酶、中性蛋白酶、淀粉酶等酶制剂。但因其存在水解蛋白酶和质粒不稳定等原因，多采用大肠杆菌-芽孢杆菌进行穿梭表达，或采用整合的方式将克隆的基因整合到宿主染色体上克服质粒的不稳定性。

1.3.3酵母菌表达体系

酵母属于低等真核生物，营养要求低、生长速度快、遗传操作简单。作为基因工程菌表达外源蛋白的技术已相应成熟，具有操作简单，表达量高，可大规模生产，并可对异源蛋白进行修饰，表达的外源蛋白具有合理的空间结构，更接近于天然蛋白质，从而成为真核表达系统的代表。

1.3.4微藻表达系统

一个以藻类为基础的生产系统将会是继大肠杆菌和酵母之后的用于大量生产抗菌肽的新一代表达平台，因为这一系统成本低廉、没有污染，又是可再生的生物发生器，而且可以达到很大的生物量。藻类每英亩产生的生物量比玉米等其他作物的30倍还多。大部分藻类能在简易的条件下生长，如只需水和碳源在阳光下藻类就可以进行光合作用，为其代谢提供能量。由农杆菌介导的基因在藻类中稳定高效表达的系统较之其它表达系统有如下优点：(1)载体能将外源基因集成到藻类细胞中，如小球藻Chlorella vulgaris；(2)经过稳定的转化可得到转基因的藻类；(3)转基因藻类很容易生长到极大的生物量；(4)真核藻类能完成糖基化修饰[2]。

微藻表达系统具有以下优势：首先是成本优势,微藻养殖不需要昂贵的培养基，大部分藻类能在简易的条件下生长，只需水、碳源和阳光藻类就可以大量繁殖，并作为生物反应器持续的生产出抗菌肽。藻类培养不需要大型发酵设备，在室外的湖泊、池塘或人工反应池中都可以大量生长，与大肠杆菌或酵母相比少了发酵设备及其使用和维护的成本。与从昆虫或者蛙等天然原料中提取相比，重组表达所得的产物更容易分离纯化，节约了下游加工的成本。其次易于产业化，藻类繁殖迅速，且能够在较小的空间里密集生长，达到极大的生物量。如藻类每英亩产生的生物量比玉米等其他作物的30倍还多，这为产业化奠定了基础。

2　抗菌肽的应用研究

抗菌肽具有广谱抗菌性、抗被膜病毒、抗寄生虫、抗肿瘤等作用，不破坏人体正常细胞，不易产生耐药性。因此，抗菌肽有望在临床医学、食品加工、日化、农业及饲料添加剂和动物药品等领域具有广阔的开发应用前景。

2.1　抗菌肽专利

通过SooPAT新世界分析[3]得出，国外关于抗菌肽的专利共有52795项(见图6，2013年4月15日SooPAT专利检索结果)，专利申请时间集中在2000年～2008年，其中美国抗菌肽专利约占世界抗菌肽专利的90%，且主要集中在抗菌肽的发现、制备方法和应用。国内抗菌肽专利申请高峰时间在2000～2012年，主要申请人是上海高科联合生物技术研发有限公司、吉林大学、华南农业大学、厦门大学、山东大学、南京农业大学、山东大学、中国农业大学。国内抗菌肽专利主要集中在医学、兽医学、生物化学、微生物学、农业、畜牧业、林业领域。

2.2　抗菌肽的开发应用

研究发现，抗菌肽除广谱抗菌抗病毒活性之外，还具有促胰岛素分泌、促进伤口愈合、提高机体免疫力等新型活性功能，这些功能的发现，展示了抗菌肽开发应用的广阔前景。目前，国内外的抗菌肽产品主要是人用抗菌肽药物和保健品、抗菌肽日化产品、抗菌肽食品保鲜剂、抗菌肽饲料添加剂和兽药三种。

2.2.1抗菌肽药物与保健品

目前，国外研究的部分抗菌肽药物已进入临床试验阶段(表1)。

表1　国外抗菌药物的开发公司与产品

国内医药公司和相关研究机构也纷纷投入抗菌肽药物和保健品开发行列。代表产品有：上海肽仕生物科技有限公司的13种抗菌肽药物原料，香港泰美国际药业集团有限公司的抗菌肽保健品胶囊，青岛中秘实业有限公司的“抗菌肽昆虫活性蛋白”，云南昆虫生物科技有限公司的“昆虫活性蛋白”等产品，山东赢升养殖专业合作社加工的含抗菌肽的昆虫蛋白粉等。除此之外，国内有多家医药公司和相关机构在研究开发抗菌肽药物。

2.2.2抗菌肽在日化用品中的应用

研究发现，抗菌肽具有杀菌消炎和促进伤口愈合的功效，既可内服也可外用，且至今未发现不良反应和细菌耐药性，这为抗菌肽在日化用品中的应用提供了条件。与药品相比，日化产品的市场准入门槛相对较低，研发和审批的周期短，市场需求量大,日化用品市场给了我们更大的想象空间。

国内市场上含有抗菌肽的日用化工产品主要集中在化妆品，以创伤疤痕修复为主，兼具温和杀菌、抗感染和消除红肿等功效，所涉及的抗菌肽包括天蚕素Cecropin、rh-aFGF和微生物抗菌肽等。国内的抗菌肽日化产品主要有：天津天狮集团有限公司的“天狮口健爽”，广州华桑生物工程有限公司的化妆品“抗菌肽修复精化”和“抗菌肽活性收缩水”，广州绿谷生物有限公司的“微生肽塑型赋活素”等美容产品，广州尚朵化妆品有限公司的“足跟保湿修复霜”，山东精彩无限生物科技有限公司的“尹姿美创伤修复型(冻干粉)”，北京秘妆堂化妆品有限公司的“深层脱敏祛痘膏”，北京海博利兹科技有限公司的可能用于洁阴洗液的“抗菌多肽”。

2.2.3抗菌肽在食品工业的应用

天然抗菌肽是生物体的自然产物，具有广谱抗菌性而对真核细胞无杀伤作用，是一种极具发展前景的新型食品防腐剂。目前，乳酸链球菌素(Nisin)已经被美国FDA批准用于食品保鲜中，它是食品领域成熟应用的唯一抗菌肽。

2.2.4抗菌肽饲料添加剂和兽药

国外市场主要集中于抗菌肽兽医的开发研究，美国ImmuCell Corporation治疗奶牛乳房炎的药物，有效成分已，与2009年提交FDA兽医中心进行审查和批复；美国已把昆虫抗菌肽做为饲料防腐剂应用于饲料业。

我国抗菌肽产品的研究、开发和应用主要集中于动物养殖和保健方面。研究发现，抗菌肽作为饲料添加剂，添加到畜禽饲料中，既能有效防止饲料霉变，延长饲料保质期，还能提高动物的抗病能力和饲料利用率。黄自然等[4]报道抗菌肽饲料添加剂应用于肉鸡预防疾病,提高存活率,增加体重和降低料肉比。刘莉如等研究发现，抗菌肽可不同程度提高蛋用仔鸡血浆IgA、IgG、溶菌酶和C3 含量，肠道大肠杆菌数量有效降低，高剂量的抗菌肽制剂可以增加肠道的乳酸杆菌与双歧杆菌数量[5]。吕尊周等[6]研究表明，饲粮中添加抗菌肽可调节机体血清免疫水平，提高蛋鸡的脾脏系数。Hancock 等在白羽母番鸭的日粮中添加天蚕素Cecropin AD 制剂，发现其肠道中的乳酸杆菌数量显著提高的同时大肠杆菌的数量显著降低[7]。李永新等将抗菌肽添加剂用于分娩前后的母猪，可提高仔猪初生重和断奶重，显著降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，提高整体养殖效益[8]。宦海琳等试验结果表明抗菌肽添加剂可以明显改善仔猪肠黏膜的形态结构，提高仔猪血清谷丙转氨酶活性、空肠上皮紧密连接蛋白的基因相对表达量和总蛋白含量[9]。张江等研究结果表明在基础日粮中添加抗菌肽制剂可明显降低牛奶中体细胞数量，提高奶牛产奶量，经济效益可观[10]。

近年来，饲料行业中的大型企业纷纷投入抗菌肽的研发与生产，香港格拉姆科技国际有限公司目前占有饲料用抗菌肽市场份额的60%以上，主要产品格莱姆系列、免疫金系列和菲肠壮系列产品；深圳瑞鑫百奥生物科技有限公司致力于防御素、抗菌肽、新型病毒性疫苗等生物医药的研发与生产，已成功实现了人类α-、 β-、和θ-防御素的产业化。大北农集团公司拥有关键菌种、发酵工艺、后处理和配套应用技术等核心技术。上海莲丰生物科技有限公司完成了研发及生产转化，肽益健由抗菌肽(蜂毒素)、丹参酮等组成，可有效杀灭或抑制引起动物与人类健康障碍的各种细菌、病毒以及寄生虫，有效的激活非特异性免疫细胞因子，使动物整体免疫力得到提高。深圳圣西马生物技术有限公司、希普集团、新希望集团、杭州安迪蜜生物工程有限公司(英资企业)、香港新亚国际药业集团等都投入大量人力物力财力进行抗菌肽产品的研究(表2)。

表2　国内饲料行业抗菌肽生产企业与代表性产品及科研项目

值得一提的是，中农颖泰集团相继成立了林州市抗菌肽研究所、安阳市多肽工程技术研究中心、河南省抗菌肽工程技术研究中心、饲用抗菌肽北京市工程实验室、生物饲料添加剂北京市重点实验室、农业部饲用抗生素替代技术重点实验室，组建了由60余名博士和硕士组成的研发团队，致力于抗菌肽的广度与深度研发。在抗菌肽研究方面，已完成了“天蚕素抗菌肽的创制与应用技术研究”的成果鉴定，技术达到国际领先水平，目前已获得国内发明专利1项，申报受理国内发明专利4项，并完成一项国际PCT专利的审核。目前，正在向农业部申报国家一类新兽药。

3　抗菌肽产业化分析

抗菌肽虽然显示具有广阔的应用前景和巨大的开发潜力，但是抗菌肽产业化道路并不如想象的那般顺畅,主要原因有以下几个方面：第一，生产成本高，生产方法有待突破；第二，抗菌肽活性还不够理想，与传统抗生素比较有很大差距；第三，安全性评价需深入研究，迄今为止，尚无资料证明，在抗菌肽长期使用后病源菌是否可能会产生耐药性。第四，抗菌肽结构、作用机制和生物功效的关系有待进一步深入研究，为抗菌肽分子改造提供理论依据。

随着抗菌肽研究的深入，越来越多种类的抗菌肽及其生物活性被发现，如何将其作用发挥到极致，如何将其造福于人类，这一命题摆在了研究人员面前。毫无疑问，研制高效低成本的抗菌肽制备生产系统是重中之重，提高抗菌肽表达量和分离纯化速度仍是其进入产业化阶段的前提。为了进一步拓展抗菌肽的应用，加快其产业化进程，在今后的研究中，一方面需要开发新的抗菌肽及其新型的生理活性，同时研究已有抗菌肽分子结构、作用机制与活性之间的关系，为完善抗菌肽表达系统提供理论基础；另一方面需要加强抗菌肽安全性研究，明确抗菌肽是否存在潜在的耐药性威胁，为抗菌肽向兽药甚至人用药物开发方向奠定基础。此外，需要开展抗菌肽分子改造方面的研究，通过基因工程技术在已有表达系统的基础上进一步改进修饰以提高抗菌肽的稳定性、减弱其溶血性。最后，就目前抗菌肽生产工艺来看，其生产成本偏高，提纯困难，生产工艺创新研究也是抗菌肽研究工作者急需解决的难题。

参考文献：

[1]Hancock RE. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials [J]. Lancet Infect Dis. 2001(3): 156-64.

[2]汇特生物医药技术有限公司. 抗菌肽调查报告.2010.

[3]黄自然, 黄国庆, 黄水彤. 新型饲料添加剂抗菌肽饲养肉鸡的效果[J]. 广东蚕业, 2006(1): 30-34.

[4]刘莉如,杨开伦,滑静,等.抗菌肽对蛋用仔公鸡生长性能、免疫指标及空肠组织相关细胞因子基因mRNA表达的影响[J].动物营养学报，2012( 7) : 1345-1351．

[5]吕尊周，袁肖笑，蔡兆伟．抗菌肽对蛋鸡血清免疫指标及脾脏白细胞介素2mRNA 表达量的影响[J]．动物营养学报，2011(12) : 2183-2189．

[6]Hancock R E，Scott M G．The role of antimicrobial peptides inanimal defences[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2000(97):8856-8861．

[7]李永新, 王强, 周洪波, 皮灿辉, 苏向东, 彭永鹤. 抗菌肽饲料添加剂对母猪生产性能的影响[J]. 饲料工业, 2009, 30(15): 20-21.

[8]宦海琳，白建勇，周维仁，等．抗菌肽对仔猪血清生化指标、肠黏膜形态结构及空肠上皮紧密连接蛋白基因相对表达量的影响[J].动物营养学报，2015，27( 12) : 3797-3804．

[9]张江，张婷婷，王涛．微生态和抗菌肽复合物对奶牛产奶量及体细胞的影响[J].饲料博览，2015(3):1-4．

[10]吴俊强，曹立亭，胡松华．乳酸链球菌素治疗奶牛乳房炎效果观察[J].中国奶牛，2008(7):41-44．