基于PRiME HLB前处理技术的鸡蛋中四环素类药物的快速筛选方法研究

张 婧 ，潘 娟，严 凤，吴剑平，李丹妮

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

四环素类抗生素(Tetracyclines，TCs) 是一种广谱抗菌素，因其抗菌性好、价格低廉，这类药物常被用于畜禽疾病的预防和治疗。兽医临床上常用的主要有四环素(TC)、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、多西环素(DOTC)等[1-2]。目前我国仅批准金霉素和土霉素可以作为饲料添加剂使用，而四环素和多西环素不允许作为饲料添加剂使用[3]。但是，一些养殖户为了追求经济效益，长期违规或超标使用此类抗生素，造成药物残留[4-5]。这不仅会影响兽药的治病疗效，也给食用者的身体健康带来严重危害[6-7]。我国针对四环素、金霉素、土霉素三种四环素类药物规定了在禽蛋中的最大残留限量为200 μg/kg[8]，针对多西环素规定了在产蛋鸡上禁用，但是，目前我国并没有发布鸡蛋中四环素类药物残留检测方法的相关标准，因此，制定相应标准尤为重要。目前国内外有关检测鸡蛋中四环素类药物残留的方法大多集中为高效液相色谱法[9-10]。多数前处理方法较为繁琐，耗时较长，无法适应当前快速筛选检测的要求。由于国内大部分检测机构还缺乏昂贵的串联质谱仪，因此，使得已有报道的HPLC-MS/MS检测方法[11-12]的应用在大多数基层实验室内难以推广。本文结合PRiME HLB快速通过式的前处理方式，开发了鸡蛋中4种四环素类药物的高效液相快速筛选检测的方法。该方法步骤简单、检测快速，能够灵敏地筛选并检测鸡蛋中四环素类药物残留，以期为鸡蛋中四环素类药物的标准制修订提供参考和依据。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂Waters高效液相色谱仪(Waters e2695-2998，Empower 3工作软件)；PRiME HLB固相萃取柱(Waters Oasis，3cc/60mg)；PL202-L感量为0.01 g电子天平、pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；AB135-S感量为0.00001 g电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)； 漩涡混合器(美国Talboys公司)；TARGIN VX-Ш多管涡旋振荡器(北京踏棉科技有限公司)。Allegra TMX-22R Centrifuge高速冷冻离心机(美国BECKMAN COULTER公司)；N-EVAP112氮吹仪(美国Orangaomation公司)；Milli-QA10 超纯水机(美国Millipore)；0.22 μm亲水PTFE过滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)。甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；乙二胺四乙酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；三氟乙酸(色谱纯，99.5%，美国Tedia公司)。标准品盐酸金霉素(纯度94.1%)、盐酸土霉素(纯度88.8%)、盐酸四环素(纯度97.5%)、盐酸多西环素(纯度85.2%)均购自中国药品生物制品检定所。

1.2药品和试剂的配制标准储备液的配制：分别精密称取盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素标准品，用甲醇定容至10 mL，配制成浓度为1 mg/mL的土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准储备液。

混合标准工作液的配制：分别准确量取金霉素、土霉素、四环素、多西环素标准储备液各1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的土霉素、四环素、金霉素和多西环素混合标准工作液。

混合标准曲线的配制：精密量取混合标准工作液适量，用流动相稀释，制得土霉素、四环素、金霉素和多西环素浓度为50、100、200、400、1000、2000、5000 ng/mL的系列混合标准工作液。

Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)的制备：取21.01 g柠檬酸用水定容至1000 mL，制成0.1 mol/mL柠檬酸溶液。取71.63 g磷酸氢二钠定容至1000 mL制成0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液。将1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液和625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液混匀，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至4.0，现配现用。

Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的制备：将乙二胺四乙酸钠60.5 g加入至1625 mL Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)中，超声溶解，混匀。现配现用。

1.3色谱条件色谱柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，粒径5 μm)，柱温为30 ℃，进样量为50 μL，流速1 mL /min，检测波长为350 nm，0.01 mol/L三氟乙酸溶液-乙腈(75:25，V/V)作为流动相。

1.4样品前处理取均质鸡蛋样品2 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中，精密加入Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液3 mL，涡旋1 min，精密加入乙腈溶液7 mL，充分振荡10 min，9000 r/min离心5 min。精密量取上清液4 mL过PRiME HLB固相萃取柱，收集滤液于40 ℃下氮气吹干。用1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜，高效液相色谱法测定。

2　结果与分析

2.1线性范围四环素、金霉素、土霉素和多西环素的混合标准工作液用流动相配制，各出峰时间如图1所示，四种药物的线性范围为50～5000 ng/mL，线性回归情况如表1。

图1　四环素类混合标准工作液色谱图(400 ng/mL)Fig 1　Chromatogram of the mixed Tetracycline standards (400 ng/mL)

表1　四环素类药物的线性回归情况Tab 1　Linear regression of tetracyclines

2.2回收率与精密度实验采用空白鸡蛋，分别添加四环素、金霉素、土霉素、多西环素标准工作液，制成含4种四环素类药物浓度为100、200、400 μg/kg的基质加标试样，进行回收率实验。空白鸡蛋基质色谱图如图2所示。每个批次同一添加水平做6次平行实验，重复3个批次，测定结果见表2。由实验结果可知，鸡蛋中四环素的回收率达59.4%～80.5%，金霉素的回收率达42.6%～63.3%，土霉素的回收率达37.1%～66.7%，多西环素的回收率达80.6%～94.6%，相对标准偏差均<30%，表明该方法满足快速筛选的分析要求[13]。

2.3检测限和定量限本方法以信噪比S/N≥3确定鸡蛋中4种四环素类药物的最低检测限为50 μg/kg，以S/N≥10确定鸡蛋中4种四环素类药物的定量限为100 μg/kg。

图2　空白鸡蛋基质色谱图Fig 2　Chromatogram of the blank matrix

表2　鸡蛋中添加四环素类药物回收率实验结果Tab 2　Tetracyclines results of recovery test in egg

3　讨论与小结

3.1提取液的选择根据四环素类药物的理化特性和相关文献报道[14]，此类药物大都含有碱性的氨基和酸性的酚羟基和烯醇基，为酸碱两性化合物，在酸性溶液(pH<7)、中性或碱性溶液(pH>7)中易与金属离子、蛋白质络合，一般在弱酸溶液中较稳定。目前国内外提取方法大多以弱酸性的含有金属络合剂的Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液(pH 4.0)提取禽蛋中四环素类药物，提取效果满意[11-12,14]。已有报道的提取液还有0.1%甲酸乙腈[15]、5%高氯酸溶液[16]的混合液等。通过比较发现，Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液(pH4.0)作为提取剂时回收率最高，0.1%甲酸乙腈混合液提取时回收率结果较低。5%高氯酸溶液提取时回收率较高，同时因净化效果好可直接取上清液上机检测，因此提取过程耗时短，但是，高氯酸溶液的强腐蚀性易腐蚀色谱柱，不适合长期大量的实际检测。基于此，本实验提取液选用Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液(pH 4.0)。此外，由于需要沉淀鸡蛋中含量较高的蛋白质，并且PRiME HLB固相萃取柱要求备用液中含有高比例有机相，所以，提取液最终选择Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液(pH 4.0)和乙腈溶液。

本实验还优化了Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液(pH 4.0)和乙腈溶液的体积比(添加含量为500 μg/kg)，分别为40∶60(V/V)，30∶70(V/V)，20∶80(V/V)，10∶90(V/V)。实验发现，当二者比例为30∶70(V/V)时，净化效果最好，回收率最高(表3)，并且含高比例有机相的备用液过柱速度及浓缩速度较快，因此，二者比例选为30∶70(V/V)。由于Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液和乙腈溶液直接混合后易变浑浊，因此，提取时先加入Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液3 mL涡旋1 min，再加入乙腈溶液7 mL振荡。

3.2净化方法的选择目前常用的净化方法包括了固相萃取、QuEChERS等方法。由于PRiME HLB固相萃取和QuEChERS方法相比，传统的C18粉和HLB固相萃取的净化方法简单且耗时短，可以满足快速筛选检测的要求。因此，本实验比较了PRiME HLB固相萃取和QuEChERS两种新一代的净化方法。PRiME HLB固相萃取柱是基于HLB填料进行的升级产品，属于反相保留机理，对于脂肪、磷脂、色素具有很好的吸附作用，可以有效去除蛋白、盐、磷脂等95%以上的基质干扰物。它是简单的通过式净化处理，无需任何活化和平衡，使得样品净化过程简单、快速、有效[17]。QuEChERS技术具备高通量、快速、成本低的特点，由于农药残留检测领域逐步被引入到兽药残留检测领域[18-19]。结合鸡蛋样品中含水量较高的特点，QuEChERS方法是加入4 g Na2SO4和1 g NaCl作为除水剂，再加入提取液振荡离心后取上清4 mL于40 ℃氮气吹干，1 mL流动相复溶后上机测定。结果表明，PRiME HLB净化方法的回收率比QuEChERS净化后的回收率更高，因此，选用PRiME HLB作为净化手段。

表3　Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液与乙腈不同体积比的提取效率研究Tab 3　Research on different volume ratios of Na2EDTA-Mcllvaine and acetonitrile

本实验还比较了不同规格大小的PRiME HLB固相萃取柱的回收率，结果发现，6cc/150mg和3cc/60mg的规格净化后的回收率无明显差异，因此，选用成本更低3cc/60mg的PRiME HLB固相萃取柱。

3.3基质效应的考察为考察本方法受鸡蛋基质效应的影响，实验采用了提取后加入法，用流动相配制了浓度为200、400 ng/mL的标准品溶液，测得响应值A；同时将空白样品经实验步骤1.4项处理后，加入混合标准工作液，配制成浓度为200、400 ng/mL的基质标准溶液，并测得响应值B。通过基质效应计算公式ME%=响应值B/响应值A×100%，得该方法中鸡蛋基质效应为85%～107%，故认为基质效应可忽略。

本实验采用Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液和乙腈溶液的提取方法，结合新一代的PRiME HLB固相萃取柱净化方法，在确保目标药物筛选回收率的基础上，建立了简单、快速的鸡蛋中四环素类药物的液相筛选方法。该方法大大简化了前处理步骤，缩短了前处理时间，提高了检测效率，更广泛地适用于大多数基层实验室。

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