杜仲叶片6种主要活性成分的遗传变异研究

庆　军，魏艳秀，王鼎涵，王　璐，刘攀峰，杜红岩，杜庆鑫*

(1 中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，郑州 450003；2 国家林业局杜仲工程技术研究中心，郑州 450003；3 国家林业局调查规划设计院，北京 100010；4 西北工业大学 附属中学，西安 710072)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)为单科单属单种，是第四纪冰川侵袭后仅留存于中国的孑遗树种，是中国特有的珍稀濒危二级保护植物和国家战略树种，具有很高的药用价值、营养价值和生态维护功能[1-2]。

作为中国传统中药材，杜仲以皮入药已有两千多年的历史。近年来研究发现杜仲叶片含有与皮相似的活性成分，具有很高的药用价值。2005年，《中国药典》(一部)将杜仲叶收录为杜仲药材。杜仲叶中活性成分主要有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类和黄酮类等[3-4]。其中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和车叶草苷为环烯醚萜类成分，具有清除自由基、降血糖、保护肝脏等作用[5-6]；绿原酸为苯丙素类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗癌、提高免疫力等作用；异槲皮苷是黄酮类成分，具有抗氧化、抗抑郁及扩张血管等多种生理活性[7]。杜仲叶除了珍贵的药用价值外，在食品、保健品及饲料添加剂等领域也有广阔的应用前景[8]。

目前对杜仲叶的研究多集中于活性成分提取、分离及药理作用评价，而对中国丰富的杜仲种质资源叶片活性成分的测定分析还未有系统研究。本研究通过对105份杜仲种质资源叶片主要活性成分(绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷、异槲皮苷及总黄酮)进行系统测定分析，对杜仲叶主要活性成分的多样性进行评价，以期筛选出活性成分含量高的优良叶用杜仲资源，从而为发掘优异种质资源、选育新品种提供基础材料，同时为杜仲资源的开发利用提供重要的理论基础。

1　材料和方法

1.1　试验材料

试验在中国林业科学研究院经济林研究开发中心杜仲基因库进行，基因库定植行间距为 3 m×3 m。利用混合取样法对105份杜仲种质材料的成熟叶片进行采集，包括雌株叶片58份，雄株叶片47份，种质来源及数量见表1。每份种质选择长势旺盛、无病虫害的6株样株进行叶的采集，每一单株从东南西北四个方向分别在枝条的中部采集典型叶片2片，共48片杜仲叶，低温冷藏带回实验室备用。

1.2　仪器与试剂

仪器：髙相液相色谱仪(配water 1525 泵、2998 PDA 检测器、2707 Autosampler)；AL204电子天平(海特勒-托利多仪器上海有限公司)；紫外可见分光光度计(Agilent CARY300)；HT-300BQ型数控超声波清洗器(济宁恒通超声电子设备有限公司)

试剂：桃叶珊瑚苷、芦丁对照品购于中国食品药品检验所，绿原酸、京尼平苷酸、车叶草苷、异槲皮苷对照品均购自于曼思特生物科技有限公司；实验所用甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为国产分析纯。

表1　种质来源与数量

1.3　测定方法

总黄酮含量采用 AlCl3 显色法[9]。绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷及异槲皮苷等5种活性成分含量测定采用改进HPLC法[10]。

1.4　数据处理与分析

采用Excel计算各成分含量的平均值(X)、标准差(S)、变异系数等基本描述。根据计算结果把105份杜仲种质6种活性成分划分为10个等级，从第1级[Xi<(X-2S)]到第10级[Xi>(X+2S)]，每0.5S为1级，并对6种活性成分在每一级占有的种质数作频次分布图。每一级的相对频率(pi)用于计算遗传多样性指数，即香农-维纳指数计算公式如下：H′=-∑piLnpi[11]，其中pi为某一性状第i级别试验材料份数占总份数的百分比[12]。采用SPSS 20.0对不同来源的杜仲种质叶片活性成分含量进行单因素方差分析和Duncan多重比较分析，利用Pearson相关系数分析各成分间的相关性，采用欧式平方距离Ward法对105份种质进行聚类分析，对聚类结果进一步作单因素方差分析和Duncan多重比较。

2　结果与分析

2.1　杜仲种质叶片6种活性成分含量变异分析

105份杜仲种质叶片6种活性成分含量见表2。桃叶珊瑚苷含量在6种成分中最高，均值为31.69 mg·g-1，其次是绿原酸的含量，均值为22.05 mg·g-1，其他活性成分由大到小的顺序为总黄酮(15.92 mg·g-1)、京尼平苷酸(9.60 mg·g-1)、车叶草苷(4.56 mg·g-1)、异槲皮苷含量(3.37 mg·g-1)。6种活性成分含量在不同种质间变异程度不同，其中异槲皮苷含量的变异系数34.42%最大，变异幅度为1.16～6.92 mg·g-1；京尼平苷酸含量变异系数居第二位，为27.71%，变异幅度为4.93～17.71 mg·g-1；总黄酮变异系数最低，为19.35%，变异幅度为6.70～22.53 mg·g-1。6种活性成分多样性指数较高，均在2.0以上，各成分多样性指数从大到小的排序为：桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸=车叶草苷、异槲皮苷、绿原酸=总黄酮。对各成分的F值分析发现，不同种质杜仲叶片6种主要活性成分差异性均达到极显著水平(P<0.01)。表明杜仲种质资源的6种主要活性成分具有较大的遗传改良潜力。进一步对杜仲雌、雄株叶片6种活性成分含量比较分析(图1)，发现杜仲雄株叶片6种活性成分含量略高于雌株，但没有显著差异。

表2　杜仲种质叶中6种活性成分含量基本参数统计

图1　杜仲雌雄株叶片活性成分对比Fig.1　Comparison of six active components in male and female leaves of E. ulmoides

图2　105份杜仲种质叶片6种活性成分频次分布Fig.2　Frequency distribution of six active component contents in leaves of 105 E. ulmoides germplasm resources

以遗传多样性测算的分级标准，分析了105份杜仲种质叶片绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷、异槲皮苷及总黄酮含量在每一级占有种质数的频次分布(图2)。6种活性成分含量分布相对集中，处于两端的种质较少，其中，绿原酸(图2，A)、桃叶珊瑚苷(图2，B)及总黄酮(图2，F)含量在1～10级均有分布，绿原酸主要集中在5～7级之间，桃叶珊瑚苷处在3～7级之间种质数较多，总黄酮集中分布于4～7级；京尼平苷酸(图2，C)、车叶草苷(图2，D)及异槲皮苷(图2，E)在2～10级上均有分布，且都集中分布于3～7级。

2.2　不同来源杜仲种质叶片6种活性成分含量差异分析

不同来源间6种活性成分含量方差分析及多重比较结果见表3，除桃叶珊瑚苷，绿原酸、京尼平苷酸、车叶草苷、异槲皮苷和总黄酮含量在不同来源间均存在显著差异。虽然不同来源间桃叶珊瑚苷差异不显著，但仍存在一定的差别，河南洛阳资源的含量(36.45 mg·g-1)最高，比最低湖南株洲资源的含量高8.49 mg·g-1；绿原酸、异槲皮苷和总黄酮含量最高的是河北安国地区种质，平均含量分别达到24.90、4.09和18.65 mg·g-1，绿原酸和总黄酮含量极显著高于山西运城和河南开封的种质，河南开封地区3种成分含量均最低，分别为15.75、2.27和13.29 mg·g-1。其中，河南洛阳地区的京尼平苷酸含量最高，其平均值达到11.33 mg·g-1，显著高于湖南株洲和贵州遵义地区，且湖南株洲地区的含量(7.25 mg·g-1)最低，仅为河南洛阳的63.99%；车叶草苷含量最高的是江苏响水地区种质，平均含量达5.05 mg·g-1，显著高于山西运城和湖南株洲地区，且湖南株洲地区的含量(3.77 mg·g-1)最低。

2.3　杜仲叶片6种活性成分含量的相关性分析

杜仲叶片6种活性成分含量的相关性分析结果(表4)表明，杜仲种质资源叶片中6种活性成分含量之间存在不同程度的相关性，其中，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和车叶草苷3种环烯醚萜类物质间均呈极显著正相关关系，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸、车叶草苷的相关系数分别为0.570和0.579，京尼平苷酸和车叶草苷的相关系数为0.256；绿原酸含量与异槲皮苷含量、桃叶珊瑚苷含量、车叶草苷含量和总黄酮均呈极显著正相关关系，而与京尼平苷酸无显著相关性；总黄酮与异槲皮苷和绿原酸呈极显著正相关关系，相关系数分别为0.543和0.346，而与其他均无显著相关性。

表3　不同来源间杜仲种质6种活性成分含量分析

注：表中数据为均值±标准差；同列不同字母表示该成分在0.05水平上差异显著；下同

Note: Data in table were X±S；The different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level； The same as below

表4　杜仲种质叶片6种成分含量间相关分析

注：*与**分别表示在0.05和0.01水平上显著相关

Note: * and ** represent significant correlation at 0.05 level and 0.01 level

表5　杜仲种质各类群性状特征

注：括号内数字表示变异系数(%)

Note: Data in the bracket are the coefficient of variation(%)

图中左侧编号为105份杜仲种质编号图3　杜仲种质叶片6种活性成分含量聚类分析105 E. ulmoides germplasm numbers were showed in the left side of the figureFig.3　Cluster analysis of six active components of E. ulmoides germplasm resources

2.4　杜仲种质叶中6种活性成分含量的聚类分析

利用 SPSS 20.0对105 份杜仲种质的6种成分进行聚类，在遗传距离为8.5处将参试材料分为 4类(图3)，各种质类群特征见表5。第Ⅰ类群包括19份种质材料，仅占总种质的18.10%，该类群种质总黄酮含量(18.72 mg·g-1)在4个类群种最高，变异系数(10.02%)在4个类群种最小；绿原酸含量(24.89 mg·g-1)和异槲皮苷含量(4.18 mg·g-1)在4类群中居第二位。 第Ⅱ类群中包括39份材料，占总种质的37.14%，是4类群中种质资源数目最多的一个类群，各成分含量表现均一般，其中车叶草苷、桃叶珊瑚苷及京尼平苷酸3种环烯醚萜类物质含量在4类群中居第二位，均值分别为33.81、10.60和5.01 mg·g-1。第Ⅲ类群包括 27份材料，占总种质的25.71%，除京尼平苷酸和总黄酮含量在4类群中处于第3位，其他4种活性成分含量在4类群中均最低。第Ⅳ类群包括20份材料，占总种质的19.05%，该类群中除总黄酮含量居第二位，其他5种活性成分含量均高于其他类群，其中绿原酸含量均值为25.37 mg·g-1，变异系数在4类群中最小，10.46%；桃叶珊瑚苷含量均值为39.99 mg·g-1；京尼平苷酸含量均值为11.53 mg·g-1，变异系数在4类群中最大，21.91%；车叶草苷含量均值为5.60 mg·g-1，变异系数在4类群中最小，10.40%；异槲皮苷含量均值为4.56 mg·g-1，变异系数在4类群中最小，22.83%；总黄酮含量均值为17.72 mg·g-1。综合分析发现，4类群中第Ⅳ类群20份杜仲种质的6种活性成分表现均较好，可为后期叶用杜仲资源的选育提供基础材料。

3　讨　论

对种质资源性状进行差异性比较分析，了解其资源的多样性，是育种工作的基础。本研究对105份不同种质杜仲叶中6种主要活性成分含量进行测定，发现杜仲叶片6种活性成分含量均较高。其中，绿原酸含量与金银花相近，表明杜仲叶片也可作为绿原酸研究的优质材料[13]，桃叶珊瑚苷含量远高于鲜地黄[14]，总黄酮含量略高于银杏叶[15]，异槲皮苷含量与罗布麻叶相近[16]。说明杜仲叶有很高的药用价值，开发利用潜力巨大。

进一步对不同种质杜仲叶片活性成分含量比较分析，发现不同种质间杜仲叶中绿原酸、异槲皮苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷及总黄酮含量差异性均达到极显著水平。这与黄玉仙[17]对不同种质薯蓣多糖含量研究结果相一致。而且杜仲叶片6种活性成分含量变异程度均较高，变异幅度较大，表现出丰富的多样性，其变异系数的变化范围介于19.35%～34.42%，6种活性成分多样性指数较高，均在2.0以上。表明杜仲种质资源的6种主要活性成分具有较大的遗传改良潜力，为优良种质选育提供了可能。

通过对各成分相关性分析，在对于种质资源中某一个成分进行选择时，就可以预测或优先考虑到该成分的筛选可能对其他成分产生的影响。本研究通过对6种成分间的相关性分析发现，车叶草苷、桃叶珊瑚苷及京尼平苷酸三种环烯醚萜类物质间均呈极显著正相关关系，绿原酸与异槲皮苷、桃叶珊瑚苷、车叶草苷和总黄酮间均呈极显著正相关关系，而与京尼平苷酸无显著相关性；总黄酮除与异槲皮苷含量和绿原酸含量呈极显著正相关关系外，与其他成分均无显著性相关性，其中相关系数分别为0.543、0.346。

聚类分析可以将性状相似的聚为一类，以便系统分析各种质特点，对植物育种和资源利用有较好的指导作用。本试验采用欧氏平方距离法将105份杜仲种质资源分为4大类群，聚类结果显示，杜仲种质资源叶片中绿原酸、异槲皮苷、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷和总黄酮含量与种质来源无明显的规律性。孙建等[18]对芝麻种质资源叶片中叶绿素含量进行多样性分析，发现聚类结果与种质来源、种质类型间无明显的规律性，傅建敏等[19]对柿资源叶片总黄酮和多酚研究也得到相似结论。这可能是由于不同地区间杜仲大规模引种栽培，导致杜仲叶片活性成分含量聚类与地理来源无关。综合比较4大类群中6种活性成分含量的高低发现，类群Ⅳ为高含量类群，共有20份种质，不仅为后期优良叶用品种的开发利用提供出基础原材料，也为杜仲活性成分的遗传改良提供了可能。

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