采用全外显子测序分析技术诊断X连锁慢性肉芽肿病一家系

许珊珊， 李奇渊,2， 吴谨准， 陈国兵， 朱碧溱， 谷为岳

慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease，CGD)是一种罕见的原发性免疫缺陷病，是因编码NADPH氧化酶的基因缺陷引起。CGD的遗传方式有X连锁隐性遗传(XR-CGD)及常染色体隐性遗传(AR-CGD)等，其中X连锁隐性遗传更为常见[1]。XR-CGD是由编码NADPH氧化酶的蛋白亚基gp91phox的CYBB基因突变引起[2-4]。2015年7月15日，笔者医院收治1例临床表现为反复感染，入院24 h内迅速死亡的患者，采用二代测序方法进行全外显子测序分析，对患者及家属进行Sanger测序验证，发现该患者携带CYBB基因上一个错义突变(c.949T>A, p.M312K)，为半合子突变，确诊为XR-CGD，报道如下。

1 病例介绍

1.1临床资料 患者，男性，1岁3月，以“发热10余天”为主诉入院。患者入院前10余天无明显诱因出现发热，经退热抗感染治疗无效，伴精神差、纳差。出生后正常接种卡介苗。患儿2月大时出现左腋下淋巴结肿大，生后多次反复发热，反复发生肛周脓肿及头皮疖肿。入院查体：体温36.0 ℃，脉搏116 min-1，呼吸32 min-1，血压120/68 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，动脉血氧饱和度(arterial oxygen saturation，SaO2)96%。面色苍白，精神差，全身皮肤散在陈旧性皮疹，部分有结痂，左腋下可及一肿大淋巴结，大小约4 cm×5 cm，边界清楚，无触痛，余浅表淋巴结未触及肿大。咽充血，咽后壁可见一溃疡，未见分泌物。颈软。双肺呼吸音粗，未闻及干、湿啰音。心音有力，律齐，心前区闻及Ⅱ/Ⅵ收缩期杂音。腹稍胀，肝肋下4～5 cm可及肿大，脾肋下未触及肿大，肠鸣音4 min-1，肛周及外阴皮肤潮红，未见破损。病理征阴性，CRT 1 s。入院后患儿生命征不稳定，出现休克症状，予扩容补液、抗感染、呼吸机辅助通气，予血管活性药物、输注血液制品、镇静等对症处理。后患儿出现心跳骤停，经抢救无效于2015-07-16死亡。

1.2二代测序 在知情同意的前提下，采集患者及其家属全血各2 mL(EDTA抗凝血)，使用血液基因组中量提取试剂盒(Blood Gen Midi Kit，中国CWBIO公司)提取全基因组DNA。参考文献及OMIM数据库、NCBI数据库的信息，将人类已知的全部(约2万个)基因的基因组外显子区域定制罗氏Nimble Gen捕获探针，进行全外显子捕获。合格的基因组DNA被Cavoris仪随机打断至200 bp左右，片段化DNA在Klenow Fragment、T4 DNA polymerase和T4PNK的作用下进行末端补平修复。在聚合酶体系下，使上一步得到的修复产物在3′末端加上A碱基，最后在两端加上接头。加上接头后的连接产物经4～6轮LM-PCR扩增，将文库与探针杂交60～68 h，使用链霉素磁珠进行洗脱，洗脱产物经10轮LM-PCR扩增。PCR产物在Illumina hiseq2500平台标准化上机测序，测序数据利用Illumina的软件进行分析处理。参考序列为hg19基因组。根据测序深度及突变质量，对检测到的变异进行过滤筛选，依据1000Genomes Project，Exome Variant Server (EVS)及Exome Aggregation Consortium (ExAC)数据库，滤除人群中突变频率>1%的变异，去除内含子变异、同义变异(除外位于剪切位点的变异)等，筛选出可能致病的变异，同时使用SIFT等软件对筛选出的突变对蛋白功能的影响进行预测。结合患儿的临床表现及遗传方式，得到可能致病的突变。

1.3一代测序(Sanger法)验证 根据CYBB基因所验证位点序列设计引物，采用PCR方法进行扩增。PCR扩增产物用ABI 3730XL测序仪测序，基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。

1.4结果

1.4.1实验室检查结果 该患儿血液免疫功能相关检查基本正常(表1)。

表1 患儿血液实验室检查相关结果

1.4.2测序结果 目标区域平均测序深度为66.08，目标区域覆盖度99.7%，89.76%目标区域>10×覆盖度，78.11%目标区域>20×覆盖度。

二代测序方法进行全外显子测序分析，发现患者的CYBB基因第9外显子存在半合子突变，进一步对患者及其家属用Sanger测序法验证该位点的突变情况，证明患者CYBB基因携带一个已知错义突变(c.949T>A, p.M312K)，来源于母亲及外婆(图1)，而其小姨并未携带该突变(参考序列NM-000397.3)。全外显子测序结果还显示，与免疫缺陷性疾病有关的3个基因存在碱基变异(表2)，但后续通过遗传方式及与临床表型的关联程度排除了该3个变异的致病性。

2 讨 论

A：患者家系图，其母亲、外祖母均为该突变的携带者；B：患者及其父母、外婆、小姨Sanger测序验证CYBB基因c.949碱基改变. 参考序列NM-000397.3.图1 患者家系图及测序图谱Fig 1 Pedigree and Sanger sequencing resultsof the family

Tab2Summary of variations in other genes related with immunodeficiency disease revealed by whole exome sequencing in this patient

基因染色体位置核酸改变氨基酸改变Rs编号突变类型SELPChr1c．1334G>C(E9)p．445，A>Grs116959152杂合NCF2Chr1c．836G>A(E8)p．279，T>Mrs13306581杂合ZAP70Chr2c．66G>T(E3)p．22，E>D-杂合

CGD是一种罕见的原发性免疫缺陷病，是由吞噬细胞功能缺陷引起的，发病率大约为1/250 000～1/200 000。其主要临床表现是严重的反复的细菌及真菌感染，以及因反复炎症造成的胃肠道、泌尿生殖道等器官的肉芽肿增生。临床诊断主要依靠典型的临床症状、硝基四唑氮蓝(NBT)试验及中性粒细胞呼吸爆发试验等[5-6]，确诊仍需依靠基因检测。本研究中，患者入院时已处于感染导致脓毒血症的状态，后迅速出现休克，于入院第2天抢救无效死亡。结合患者既往多次感染病史，考虑其患有某种免疫缺陷病，患者死亡时免疫功能相关检查(体液免疫及细胞免疫功能)尚未回报，因此在征得患者家属同意的情况下，及时外送基因检测公司进行全外显子测序，最终证实了XR-CGD的诊断。回顾性分析该患者的临床表现，与CGD相符。其主要表现为反复感染，感染部位累及皮肤(头皮、肛周)及肺，同时还有卡介苗接种同侧腋窝淋巴结肿大。实验室检查提示，细胞及体液免疫功能正常。因此，对于临床上有患者出现反复感染，怀疑免疫缺陷，但常规细胞免疫及体液免疫功能却正常的患者，应考虑CGD可能。

CGD是因编码NADPH氧化酶的基因缺陷引起。NADPH氧化酶由5个蛋白亚单位组成：gp91phox，p22phox，p47phox，p67phox，p40phox。其中XR-CGD是最常见的类型，约占CGD病例的60%，是由编码gp91phox蛋白的CYBB基因突变引起[3-4]。CYBB基因位于Xp21.1，该基因长30 kb，包含13个外显子。据HGMD网站报道，截止至2015年12月已发现CYBB基因突变700余种，最常见的突变类型是错义突变。不同的突变引起吞噬细胞gp91phox蛋白功能表达的不同，从而引起氧化酶功能障碍[2]。

本例患者携带的突变为c.949T>A，引起第312位蛋白质由蛋氨酸变为赖氨酸。该突变由Lee于2008年报道[7]，Lee的研究中携带该突变的患者的临床表现为肺脓肿、肛周脓肿及淋巴结炎，无结核及卡介苗接种并发症。本研究中，患者接种卡介苗的同侧腋窝淋巴结出现明显肿大，余淋巴结未见肿大，但因未行淋巴结活检，未能推测其是否有淋巴结结核或卡介苗感染。Lee等报道，17例患者中有14例患有结核或卡介苗相关并发症，患病率较高[7]。在我国，卡介苗属于计划免疫的部分，一般在生后3 d内接种，所以对于有免疫缺陷病家族史的患儿，避免接种卡介苗可减少结核或卡介苗感染的发病率。目前美国已采用TREC试验对重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)进行筛查[8]，期待未来能针对CGD、SCID等免疫缺陷病开展新生儿筛查。

Roos等还报道过1例CYBB基因第312位蛋白质改变的病例[2]。该患者的947位碱基T被替换为G，从而导致蛋氨酸变为精氨酸，进行蛋白表达及酶学测定后，判定其为x91+型，即gp91phox蛋白表达正常，NADPH氧化酶活性缺失[4]。本病例与该病例相比，同为第949位碱基发生改变，导致312位蛋白质变为精氨酸或赖氨酸，二者均有带正电荷的侧链，同为碱性氨基酸。所以推测c.949T>A(p.M312K)可能也为x91+型，可引起酶活性基本缺失。

近几年，随着二代测序技术的发展，费用降低，测序速度加快，已成为罕见单基因遗传病诊断的重要方法之一。通过二代测序技术，可以快速地对目的基因组合或全外显子进行测序，使得对罕见病、疑难病的诊断变得更加容易[9]。如本例患者，病情进展迅速，入院1 d内即死亡，临床实验室检查尚来不及完善，而通过二代测序技术进行全外显子测序分析，明确诊断，并可对家属提供遗传咨询。由于同时对全外显子进行测序，测序结果可能会提示多个基因携带变异。如本研究全外显子测序结果显示了另外3个与免疫缺陷性疾病有关的基因上存在碱基变异。与SELP基因及NCF2基因相关的疾病为遗传性IgE反应过敏症及遗传CGD细胞色素B阳性2型，均为常染色体显性遗传，但在此2个基因上发现的变异均为NCBI dbSNP数据库中记载的已知SNP位点，其临床意义为良性。因ZAP70突变引起的选择性T细胞缺陷病为常染色体隐性遗传病，该患者携带ZAP70杂合突变，故不会致病。所以全外显子测序检测出的这3个基因变异均无临床意义。这就需要临床医师进行鉴别分析，过滤或剔除无用信息，找到真正的致病突变。

综上所述，对于临床症状不典型，或因不可抗拒原因(如患者死亡)而造成临床资料不完善，无法进行临床诊断时，采用二代测序技术进行目的基因组合或全外显子测序，可以帮助医师明确诊断，并对患者家庭提供可靠的遗传咨询。

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