人结直肠癌耐药细胞株HCT-8/L-OHP的构建及HOXB8过表达的探讨

徐宗斌， 张逸羿， 卢星榕， 池 畔

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，在全世界癌症相关死亡原因中排第3位[1]。2011年我国CRC的发病率和病死率分别为23.03/100 000和11.11/100 000，且发病率较以往明显升高，多数患者确诊时已属中晚期[2]。2017年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)指南推荐，晚期转移性结肠癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)患者采取以手术为主、化疗为辅的综合治疗方案，含有奥沙利铂(L-OHP)的FOLFOX及CAPOX方案为一线化疗方案。然而，采用标准化治疗方案的晚期患者5年生存率不足10%[3]，主要原因是肿瘤细胞对化疗药物的抵抗作用，导致L-OHP的应用受到较大的限制。目前，针对L-OHP耐药的研究仍缺乏有效进展，其耐药机制仍在探索中。

HOX基因又名Ⅰ型同源异形盒基因，是一类在进化上高度保守的基因家族。HOX基因通过调控凋亡、增殖等参与脊椎动物胚胎发育和器官形成过程。近年研究发现，HOX基因表达的改变与肿瘤的发生、发展密切相关[4]。笔者前期研究显示，在术前接受含L-OHP化疗方案的mCRC患者中，基因芯片发现响应与不响应组中HOXB8基因呈现显著的差异表达，免疫组织化学检测也验证了上述发现[5-6]。但目前尚无研究显示，HOXB8在肠癌耐药细胞系中是否有相同的差异表达。因此，本研究拟建立人CRC的L-OHP耐药细胞模型，并初步探讨HOXB8在耐药细胞株的表达是否存在差异，为进一步探索L-OHP的耐药机制打下基础。

1 材料与方法

1.1材料 人CRC细胞HCT-8(上海吉凯基因化学技术有限公司)；1640培养液(美国Gibco公司)；标准胎牛血清(厦门鹭隆生物工程材料有限公司)；TRIzol、cDNA合成试剂盒(美国Invitrogen公司)；噻唑蓝(MTT，中国上海华舜生物工程有限公司)；AnnexinⅤ-cy5凋亡和周期检测试剂盒(美国BD Pharmingen公司)；qPCR扩增试剂盒(上海诺伦生物医药技术有限公司)，PCR各引物由上海生工生物公司合成；兔抗人多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)、核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross completion gene 1, ERCC1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、谷胱甘肽-巯基-转移酶-π(glutathione-s-transferase-π, GST-π)及HOXB8单克隆抗体(美国Abcam公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及HCT-8/L-OHP的建立 癌细胞株HCT-8培养于含10%胎牛血清的1640完全培养液中。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×105mL-1，加入终浓度为2 μmol/L(约1/3 IC50)的L-OHP培养液连续作用48 h，弃上清液，加入不含L-OHP的新鲜培养液继续培养，待细胞恢复正常生长后，消化传代，复用2 μmol/L的L-OHP溶液连续作用48 h。重复上述步骤，一个浓度反复3～4次，如此反复换液、传代，逐步提高L-OHP的浓度至20 μmol/L，最终获得能耐受20 μmol/L L-OHP的细胞株，并将其维持培养在含10 μmol/L L-OHP的完全培养液中，建立人CRC耐药细胞株HCT-8/L-OHP，直至细胞可在含10 μmol/L的 L-OHP培养液中稳定生长。对应的野生细胞进行同样的传代，但不加药处理。

1.2.2MTT法检测各种抗癌药的细胞毒作用 取对数生长期的HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，消化离心后调整细胞浓度为5×104mL-1。每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板。培养24 h后，加入倍比稀释成5种浓度的各种抗癌药物[L-OHP，5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(CPT-11)、顺铂(CDDP)及长春新碱(VCR)]各20 μL，每一浓度重复5孔，并设置空白对照和隐形对照组。培养48 h后，吸去上清液，每孔加无血清培养液200 μL及5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h，吸去上清液，每孔加100 μL的DMSO，置于微量振荡器上振荡5 min，在570 nm波长处计算各组的IC50。

1.2.3细胞形态学观察 (1)光镜观察：收集HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞,接种至内铺小玻片的24孔培养板内，培养72 h后，光镜下观察、拍照。(2)透射电镜观察：收集HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，用2.5%戊二醛固定，继续用2%四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色，透射电镜观察、拍照。

1.2.4细胞群体倍增时间和细胞生长曲线测定 取对数生长期的HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，消化离心，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104mL-1。取2 mL细胞悬液接种至25 mL培养瓶内。自第1天开始用台盼蓝拒染法，以血球计数板进行活细胞计数，每日取3瓶细胞，计算均值，连续观察7 d。调整2种细胞浓度为5×103mL-1，接种8块96孔板，每孔200 μL(1×103)，各设6个平行孔，每天用MTT法测2种细胞的吸光值。以培养时间为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.2.5流式细胞仪(flow cytometry，FCM)分析细胞周期分布及细胞凋亡情况 收集HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，加入-20 ℃预冷的70%乙醇，固定1 h。将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4 ℃下放置30 min。以激发波长为488 nm测定，并用ModFit LT2.0软件分析细胞周期分布。取HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，均予以20 μmol/L的L-OHP培养液作用48 h，收集培养液以及细胞，根据试剂盒说明书的操作步骤加入凋亡检测试剂，检测细胞凋亡情况。

1.2.6检测HCT-8及HCT-8/L-OHP细胞株ERCC1，ABCB1，ABCC1，GST-π及HOXB8基因的表达

1.2.6.1qPCR检测 TRIzol法提取各组总RNA，取1 μg RNA反转录为cDNA，反转录条件为：42 ℃ 60 min→70 ℃ 5 min。产物进行荧光定量PCR扩增，反应条件如下：94 ℃ 2 min，1个循环；94 ℃ 15 s→62 ℃ 40 s，40个循环。采用ΔΔCt相对定量法分析结果，差异水平用2-ΔΔCt表示。

ΔΔCt=实验组(Ct目的基因-Ct管家基因)-对照组(Ct目的基因-Ct管家基因)

GAPDH(Human)：

F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′

R:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′

ABCC1(MRP or MRP1)：

F:5′-ATCTTGGTCACGCACAGCAT-3′

R:5′-GCATAGGTACGCAGGAACTCA-3′

ABCB1(P-gp)：

F:5′-AACACCACTGGAGCATTGACTAC-3′

R:5′-ATTACAGCAAGCCTGGAACCTAT-3′

GSTP1：

F:5′-ACCGTGGTCTATTTCCCAGTTC-3′

R:5′-AGGTGACGCAGGATGGTATTG-3′

ERCC1：

F:5′-TTTGGCGACGTAATTCCCG-3′

R:5′-TCCGCTGGTTTCTGCTCATAG-3′

HOBX8：

F:5′-CAGACCTACAGCCGCTACCA-3′

R:5′-CGCCGCTTACGAGTCAGATA-3′

1.2.6.2Western-blot检测 细胞加入裂解液RIPA(100 μL/106个细胞)和1 μL蛋白酶抑制物PMSF，吹打冰浴30 min，4 ℃高速离心15 min，收集上清液。以20～40 μg蛋白上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗3次，每次10 min。分别加入ERCC1，ABCB1，ABCC1，GST-π及HOXB8一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入羊抗鼠或羊抗兔二抗，室温孵育2 h。用Bio-Rad凝胶成像仪显影。

1.3统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料采用或中位数表示，并用t检验、秩和检验进行统计学分析；计数资料采用率(或构成比)表示，采用卡方检验进行统计学分析。检验水准α设定为0.05。

2 结 果

2.1耐药细胞系构建成功鉴定

2.1.1成功建立人CRC多药耐药细胞株HCT-8/L-OHP 培养7月后，获得生长良好的、能耐受20 μmol/L L-OHP的耐药细胞株HCT-8/L-OHP，可在含10 μmol/L L-OHP的培养液中稳定生长。MTT法检测结果显示，亲本株对L-OHP的IC50值为5.78 μmol/L，耐药株的IC50为62.33 μmol/L、RI为10.78。使用未加L-OHP的培养基培养1月后，测得耐药株的IC50为56.41 μmol/L，RI为9.75。将HCT-8/L-OHP细胞冻存，3月后经细胞复苏，仍能稳定增殖和生长，IC50为58.21 μmol/L，RI为10.07，耐药性基本保持不变。HCT-8/L-OHP细胞不仅对L-OHP产生耐药性，而且对另外4种临床常用的抗癌药物(5-FU，CPT-11，CDDP及VCR)也产生不同程度的耐药性，具有多药耐药特征(表1)。

表1 HCT-8/L-OHP细胞的多药耐药检测

FU：5-氟尿嘧啶； CPT-11：伊立替康； CDDP：顺铂； VCR：长春新碱.

2.1.2HCT-8及HCT-8/L-OHP的细胞形态

2.1.2.1光镜观察 HCT-8细胞贴壁生长，呈上皮样单层排列，细胞大小一致，为圆形或椭圆形，边界清楚，胞核大而圆，颜色深，胞质内含颗粒；HCT-8/L-OHP细胞也呈上皮样单层排列，但形态发生明显改变，细胞大小不均，细胞变大，多呈梭形，部分细胞变圆，折光性变强，核大、色深、不规则(图1)。

A：HCT-8细胞(×100)；B：HCT-8细胞(×200)；C：HCT-8/L-OHP细胞(×100)；D：HCT-8/L-OHP细胞(×200). HCT-8细胞大小一致，边界清楚；HCT-8/L-OHP细胞大小不均，呈梭形，折光性变强，核大、色深、不规则.图1 HCT-8和HCT-8/L-OHP光镜观察Fig 1 HCT-8 and HCT-8/L-OHP in light microscope

2.1.2.2透射电镜观察 HCT-8细胞核清晰，形态不规则，核仁明显，核内可见较多的常染色质，未见异染色质；线粒体丰富，其结构及板块嵴清楚完整，细胞表面微绒毛比较丰富。耐药株细胞核大，多见核畸型，染色质增多，少量异染色质，胞质内出现脂滴，线粒体出现肿胀、空泡，粗面内质网扩张，细胞表面微绒毛减少、变短(图2)。

2.1.3细胞生长曲线的绘制和细胞群体倍增时间的检测 通过MTT实验绘制生长曲线，HCT-8细胞：y=0.176 3x-0.052 8，R2=0.990 8；HCT-8/L-OHP细胞：y=0.056 1x+0.082 1，R2=0.984 4。耐药细胞增殖减慢；群体倍增时间HCT-8和HCT-8/L-OHP分别为28.76和64.57 h(图3)。

A：HCT-8细胞(×16 300)； B：HCT-8/L-OHP(×28 000). HCT-8细胞核清晰，未见异染色质；HCT-8/L-OHP核大，多见核畸型，染色质增多，少量异染色质.图2 HCT-8和HCT-8/L-OHP透射电镜观察Fig 2 HCT-8 and HCT-8/L-OHP in electron microscope

HCT-8/L-OHP细胞增殖较HCT-8减慢，群体倍增时间延长.图3 HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞的生长曲线Fig 3 The growth curve of HCT-8 and HCT-8/L-OHP

2.1.4细胞周期分布和凋亡检测

2.1.4.1细胞周期分布 细胞周期分布分析显示，HCT-8/L-OHP细胞在G2/M期所占比例(18.97%)较HCT-8细胞(4.48%)增多(P<0.01)，同时在S期(26.43%)及G0/G1期(64.33%)所占比例减少，与HCT-8细胞比较，差别具有统计学意义(P<0.01)。

2.1.4.2细胞凋亡检测结果 凋亡情况检测结果显示，HCT-8/L-OHP细胞早期和晚期凋亡合计约43.47%，而HCT-8细胞的凋亡率约75.47%。提示耐药株的凋亡率明显低于亲本株，二者差别有统计学意义(P<0.01，图4)。

Tube001为HCT-8，Tube004为HCT-8/L-OHP.图4 HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞凋亡情况Fig 4 The apoptosis of HCT-8 and HCT-8/L-OHP

2.2HOXB8以及ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1，ERCC1的mRNA表达情况 耐药株HCT-8/L-OHP的ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，ERCC1及HOXB8的mRNA表达均上调，与亲本株HCT-8比较，差别具有统计学意义(P<0.05，表2，图5)；而GSTP1 mRNA的表达二者间差别无统计学意义(P>0.05)。

表2 各基因mRNA的相对表达量

与HCT-8细胞株比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

与HCT-8细胞株比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.图5 各基因mRNA的相对表达量Fig 5 The relative of indicate gene mRNA expression

2.3HOXB8，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1蛋白表达情况 Western-blot检测结果显示，HCT-8/L-OHP细胞的HOXB8，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1蛋白均呈现相对高表达，与HCT-8细胞比较，差别具有统计学意义(P<0.01，图6)。

图6 各基因蛋白表达结果Fig 6 The Western-blot analysis of indicate gend

3 讨 论

CRC是临床最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例数达94.5万例，每年有近50万人死于CRC[3]。根据2017年NCCN指南，mCRC患者的标准治疗为姑息化疗，其中含L-OHP的FOLFOX及CAPOX方案为一线化疗方案，可获得近50%的缓解率[7]，但仍有近一半的患者对化疗不敏感，且绝大部分初期化疗敏感的患者终因肿瘤获得性耐药导致化疗失败。因此，寻找肿瘤细胞对化疗药物抵抗的靶点，探索肿瘤细胞对化疗抵抗的机制是克服肿瘤细胞耐药性、提高化疗药物疗效的关键。成功构建能够稳定耐药的细胞系是研究耐药的产生、预防和逆转的重要研究模型[8-10]。

目前，常见的建立耐药细胞株方法有以下2种：采用递增药物浓度持续作用和恒定药物浓度周期作用来进行诱导。研究显示，前者比后者诱导细胞耐药性更强且更稳定[11]。本研究采用前者建立耐药细胞株，结果发现，耐药细胞的形态发生明显改变，细胞代谢率降低，生物活力减弱，群体倍增时间是亲本细胞株的2.25倍，说明耐药细胞株增殖速度减慢，与张立阳等的研究结果类似[12]。随着肿瘤细胞倍增时间的延长，细胞对化疗药物的敏感性降低[13]。从细胞周期的分布发现，耐药株细胞在G2/M期所占比例增多，提示细胞发生G2/M期阻滞，这与其他研究者所建立的耐药细胞株结果相似[14]。另外，细胞凋亡检测发现，耐药细胞株在相同浓度的L-OHP作用下凋亡率更低，进一步佐证了耐药细胞株对L-OHP有更强的抵抗作用。耐药细胞株不仅对L-OHP有抗性，对5-FU，CPT-11，CDDP及VCR也具有一定抗性，产生多药耐药。研究显示，5-FU及CPT-11在CRC患者体内的血药浓度常维持在30和10 μg/L左右[15-16]。本研究中耐药细胞株对5-FU及CPT-11相对耐药可达1 587.22和40.21 μg/L，可见本研究所建立的耐药细胞株可抵抗临床用药浓度。

肠癌细胞对L-OHP的抵抗可能与DNA损伤修复系统的过表达以及蛋白质差异表达相关，其中核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)过表达、膜转运体蛋白过表达以及GST-π过表达等可能通过其调控的基因及其下游事件发挥相应作用[17-19]。本研究还发现，在耐药细胞株中，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1等常见耐药基因表达呈现显著性的差异上调。由于在产生对L-OHP耐药的同时，上述机制的表达异常引起耐药细胞株对其他药物产生抵抗，本研究也证实了该结果。

HOX基因家族是动物胚胎发育过程中的主控基因，目前有较多的研究证实，HOX基因表达异常与肿瘤的发生发展有关[20-23]。HOXB8基因是HOX 基因家族的成员之一，位于17p21.3，编码同源框DNA结合域的核蛋白，参与细胞的正常分化、发育。兰鸿波等研究显示，HOXB8的过表达与肿瘤的发生发展呈现正相关，并可能通过miR-196调控，miR-196可能与AKT通路的激活相关[24-25]。Ding等研究也显示，HOXB8的过表达可能与胃癌的发生发展以及转移侵袭能力呈正相关[26]。本课题组在评估接受含L-OHP方案的CRC患者的疗效时发现，在响应与不响应组中，HOXB8基因呈现显著的差异表达[5]。本研究成功构建L-OHP耐药细胞株，并通过qPCR以及Western-blot揭示了HOXB8基因在耐药细胞株呈现明显差异表达。进一步证实了HOXB8的过表达可能与L-OHP耐药相关，但尚未明确HOXB8通过何种方式调控耐药的产生。

本研究成功构建了L-OHP耐药细胞株，发现其与耐药蛋白的过表达、DNA修复系统的过表达以及GST-π过表达相关，并发现HOXB8基因在耐药株中呈现过表达，但其参与耐药机制尚需进一步研究。

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