白藜芦醇通过抑制自噬相关蛋白LC3 I/II和beclin-1表达促进H2O2处理的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

俞晨，张俊强，曹威，王高远，汪陶荣 ，殷瞳昕，陈晓宇*

（1皖西卫生职业学院护理学系，六安 237000；2安徽医科大学组织学与胚胎学教研室，3安徽医科大学第一附属医院骨科，合肥 230022）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是慢性关节滑膜炎症，表现为慢性、系统性和破坏性的自身免疫性关节疾病。RA患者表现为成纤维样滑膜细胞（ fi broblast- like synoviocytes，FLS）类肿瘤样生长致关节局部结构破坏[1]。研究证实[2]，RA患者机体存在的氧化应激状态，且促进滑膜组织增生。白藜芦醇（resveratrol，Res）是从葡萄、虎杖等植物中提取的多元酚类植物抗毒素，具有抗炎、抗氧化、抗老化和预防肿瘤的特性[3]。本研究旨在进一步探讨Res对RA患者的抗氧化作用以及自噬在其中的影响。

材料与方法

1 试剂和主要仪器

白藜芦醇（纯度≥99%，美国Aladdin公司）；30%H2O2（北京万佳首化生物科技有限公司）；CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒（日本同仁化学公司产品）；DMEM高糖培养基和胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白试剂定量盒（美国Pierce公司）；兔抗人LC3 I/II和兔抗人beclin-1（美国abcam公司）；TUNEL染液、青链霉素溶液、蛋白预染Maker、一抗稀释液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG和ECL化学发光液（碧云天生物有限公司）；硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜（美国Millipore公司）；半干转膜仪（大连竞迈生物科技有限公司）；多功能酶标仪（美国Thermo公司）。

2 MDA、SOD和GSH-Px分光光度计检测

抽取住院RA患者空腹静脉血，离心后置于-20℃冰箱中保存待测。按照说明书操作程序进行MDA含量硫代巴比妥酸法、SOD活性羟胺法和GSH-Px活性比色法检测，进行。同时，取同期门诊健康体检正常人血清作为对照，RA患者和正常人一般情况，包括年龄、性别等差异无显著性，两组具有可比性。实验过程患者和健康体检者知情同意。

3 滑膜细胞的分离培养

采取组织块培养法，参照文献[4]并改进。RA患者膝关节镜无菌下取出的滑膜组织，剪成约1mm3大小碎块，含10%FBS的Ⅱ型胶原酶消化约2h；0.25%的胰蛋白酶消化，将细胞重悬于含15% FBS的DMEM培养液, 吹打均匀接种于培养皿中，37℃、5%CO2培养箱内培养，3～4d换液1次。待细胞长至≥70%时，进行传代培养。实验所用细胞为第3～5代。

4 细胞增殖的CCK-8法检测

将RA-FLS接种于96孔板中，每孔加入100µl细胞数为2.0×103个，每组设4复孔，次日细胞贴壁后加药处理。设不同浓度的H2O2处理组（0、1、5、10、20、40、80、100μmol/L）预先处理FLS 24h后，每孔加入10μl CCK-8工作液，继续在培养箱中培养4h。酶标仪测定在450nm处吸光度A值。

5 RA-FLS凋亡的TUNEL法检测

严格按照操作说明书，采用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡检测试剂盒检测FLS的凋亡情况。将RA-FLS接种于6孔板中，转移至玻片，培养24h，孵育5 µmol/L H2O212h，Res孵育24h，PBS洗10min×3遍，并用反应缓冲液37°C 下暗室中孵育30min。苏木精复染显示细胞核，凋亡细胞被染成棕色。

6 自噬相关蛋白的Western blot检测

将对数生长期RA-FLS按照2×105/孔细胞接种于6孔板，待细胞生长密度约80%时，如上加药处理24h后，用RIPA裂解液提取总蛋白，4℃、12000r/min离心5min；取上清液，BCA蛋白试剂盒蛋白定量，SDS-PAGE电泳（分离胶10% , 浓缩胶5%），半干转膜仪转膜1h，5%脱脂奶粉室温封闭2h，4℃孵育LC3I/II、beclin-1抗体过夜，TBST洗膜10min×3次，二抗室温孵育2h，TBST洗膜10min×3次，ECL化学发光，曝光压片，显影、定影。

7 统计学处理

结 果

1 白藜芦醇抑制RA患者血清中MDA含量增加与SOD和GSH-Px活性降低

与正常健康体检者比较，RA患者血清中MDA含量明显升高，SOD和GSH-Px活性显著降低，差异有显著性（表1），即RA患者氧化应激增强。

表1 RA患者血清MDA含量与SOD和GSH-Px活性Tab. 1 Serum MDA levels and the activities of SOD and GSH-Px in RA patients

2 H2O2对RA-FLS细胞增殖的影响

CCK-8法检测RA-FLS细胞增殖情况显示，给予不同浓度的H2O2处理24h后（将以0μmol/L H2O2处理的对照组细胞活力设为100%），1～5μmol/L H2O2可促进RA-FLS细胞增殖，当H2O2浓度继续升高，RA-FLS细胞增殖活力逐渐降低，当H2O2浓度达100μmol/L，RA-FLS细胞活力几乎为零（图1）。故在体外实验中，我们选择低浓度（5μmol/L）H2O2作为刺激RA-FLS细胞生长浓度。

图1 H2O2对RA-FLS细胞增殖的影响（n=5）Fig.1 Effect of H2O2 on RA-FLS proliferation（n=5）

3 白藜芦醇诱导低浓度H2O2处理的RA-FLS凋亡

TUNEL法检测不同浓度Res（0、5、20、50、100 μmol/L）对经低浓度（5μmol/L）H2O2处理的RA-FLS凋亡显示，0μmol/L Res处理未见明显FRAFLS凋亡现象；随着Res浓度的升高，FLS凋亡呈增加趋势（图2）。

图2 白藜芦醇诱导低浓度H2O2处理的RA-FLS凋亡（TUNEL染色）。A，0μmol/L Res；B，5μmol/L Res；C，20μmol/L Res； D，50μmol/L Res； E，100μmol/L Res；F，200μmol/L Res；比例尺，50μmFig. 2 Resveratrol induces the apoptosis of RA-FLS treated with 5μmol/L H2O2. A, 0μmol/L Res; B, 5μmol/L Res; C, 20μmol/L Res; D, 50μmol/L Res;E, 100μmol/L Res; F, 200μmol/L Res; scale bar, 50μm

4 白藜芦醇对自噬蛋白Beclin-1和LC3I/II表达的影响

Western blot检测不同浓度 Res（0、5、20、50μmol/L）对经5μmol/L H2O2处理的RA-FLS自噬相关蛋白表达的影响显示，与0μmol/L Res处理的对照组比较，随着Res浓度（5、20、50μmol/L）上升，自噬蛋白beclin-1和LC3 I/II的表达量逐渐降低。

讨 论

类风湿关节炎的发病中氧化应激性反应是一个重要因素，RA患者由于长期关节疼痛、功能受限、治疗等，机体常常处于应激状态，导致机体脂质过氧化反应，增加活性氧自由基（ reactive oxygen species，ROS）[5]。生物膜脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的浓度高低表示组织细胞受ROS氧化损伤程度，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）是机体重要的抗ROS损伤酶类，保护生物膜结构和功能的完整性[6]。本研究表明，与正常健康对照者比较，RA患者存在血清MDA的浓度下降，GSHPx和SOD活性升高现象，进一步证实RA患者体内存在氧化应激状态。

图3 白藜芦醇对低浓度H2O2处理的RA-FLS内Beclin-1和LC3I/II表达的影响Fig. 3 Effect of Resveratrol on the expression of Beclin-1 and LC3I/II in RA-FLS treated with 5μmol/L H2O2

RA患者的主要特征为滑膜增厚，其中成纤维样滑膜细胞（FLS）、炎细胞（包括淋巴细胞和巨噬细胞）形成血管翳，形成渗透物浸润破坏局部的关节结构，FLS在RA发病过程中至关重要[7]。另外炎细胞和FLS可产生促炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等，刺激活化的巨噬细胞和中性粒细胞分泌ROS，损伤关节结构[8]。为探讨RA患者机体氧化应激对FLS生长的影响，我们采用组织块和胶原酶消化作用，体外培养RA-FLS；然后用CCK-8法，检测不同浓度的H2O2对FLS增殖的影响，研究发现，低浓度（1～5μmol/L） H2O2可促进FLS细胞增殖，当H2O2浓度继续升高，FLS增殖活力逐渐下降，故在体外实验中以H2O2（5μmol/L）作为刺激FLS细胞生长浓度。我们前期研究已证实[3,4]，在RA的常用动物模型佐剂性关节炎（AA）大鼠模型组中存在氧化应激，白藜芦醇（Res）可以降低AA大鼠氧化应激。本研究通过TUNEL法检测不同浓度Res对低浓度H2O2处理RA-FLS细胞凋亡的影响，结果表明，RA-FLS凋亡随着Res浓度的升高而增加。

ROS在诱导细胞自噬方面起重要作用，通过氧化调节自噬转录因子，进而调节自噬蛋白[9]。有研究发现[10]，正常条件下，自噬相关蛋白beclin-1与凋亡相关蛋白Bcl-2 或Bcl-XL相互结合，导致beclin-1形成吞噬泡，在LC3 I/II作用下延长包绕线粒体并发育成熟，然后与溶酶体结合，引发线粒体自噬。为了解Res引起RA-FLS细胞凋亡的机制，我们研究了自噬相关的标志物LC3 I/II和beclin-1蛋白的表达变化。结果显示Res处理24h后，随着Res浓度增加而自噬作用减弱。因此，RA-FLS凋亡可能是由氧化应激和自噬通路蛋白表达下降引起ROS的积累，过多的ROS引起FLS细胞的凋亡。

综上所述，RA患者机体存在脂质过氧化，一定范围的过氧化会引起RA-FLS异常增殖，Res对RAFLS的异常增生的抑制作用，诱导FLS凋亡，其机制可能与氧化应激和自噬通路蛋白表达下降有关。

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[4] 俞晨，张俊强，储海峰，等.白藜芦醇对过氧化氢诱导滑膜细胞凋亡的作用及 机制. 解剖学杂志，2016，39（4）：431-435.

[5] Lee JY, Choi JK, Jeong NH, et al. Anti-in fl ammatory effects of ursolic acid-3-acetate on human synovial fi broblasts and a murine model ofrheumatoid arthritis. Int Immuno pharmacol, 2017, 49: 118-125.

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